胡芦巴丸活性组分改善糖脂代谢紊乱的机理研究

发布时间：2020-05-23 17:16

【摘要】：第一部分从ER-α/PI3K/Akt信号通路探讨胡芦巴丸活性组分改善HepG2细胞胰岛素抵抗的机理研究目的比较胡芦巴丸活性组分薯蓣皂苷元(DSG)、补骨脂素(5-MOP)以及薯蓣皂苷元和补骨脂素(DSG/5-MOP)对人肝癌细胞(HepG2)胰岛素抵抗细胞模型的影响,并探索其相关分子机制。方法采用10-6mol/L胰岛素干预HepG2细胞36h,建立高胰岛素诱导的胰岛素抵抗细胞模型。根据所给予相应的药物干预,分为DSG(10-5mol/L)组、5-MOP(10-6mol/L)组、DSG/5-MOP(10-5 mol/LDSG 和 10-6 mol/L5-MOP)组、雌二醇((β-Estradiol,10-6 mol/L)组,另设模型组和对照组。免疫荧光激光共聚焦观察雌激素受体-α(ERα)的分布与表达;葡萄糖氧化酶法检测上清液葡萄糖消耗;蒽酮法测定细胞内糖原含量;Western Blot检测ERα、src蛋白(3c)、磷酸肌醇-3激酶p85亚单位(P13Kp85)、蛋白激酶B(Akt)、糖原合成酶激酶3-β(GSK-3β)的磷酸化蛋白/总蛋白表达水平,免疫荧光检测葡萄糖转运体-4(GLUT-4)的表达。结果免疫荧光激光共聚焦显微镜显示ERα在HepG2细胞的胞膜、胞浆、胞核中均有表达,与对照组比较,模型组细胞内ERα表达降低;与模型组相比,DSG组、5-MOP组、DSG/5-MOP组和β-Estradiol组ERα表达增加。与对照组比较,模型组细胞内糖原合成、细胞上清葡萄糖消耗显著减少(P0.01,P0.05);与模型组相比,DSG组、5-MOP组、DSG/5-MOP组和β-Estradiol组细胞内糖原合成、细胞上清葡萄糖消耗显著增加(P0.01,P0.05),且与DSG组相比,DSG/5-MOP组细胞上清葡萄糖消耗显著减少(P0.05)。与对照组比较,胰岛素抵抗细胞模型组的细胞内p-ERα/ER、p-src/src、PI3Kp85/β-actin、p-Akt/Akt、p-GSK-3β/GSK-3 表达显著降低(P0.01,P0.05);与模型组相比,DSG 组、5-MOP 组、DSG/5-MOP 组和 β-Estradiol 组 p-ERα/ER、p-src/src、PI3Kp85/β-actin、p-Akt/Akt(β-Estradiol 组 p-Akt/Akt 与模型组相比无显著性差异)、p-GSK-3β/GSK-3β 表达显著增加(P0.01,P0.05);与 DSG 组相比,DSG/5-MOP组p-src/src表达显著增加(P0.01)。与对照组比较,胰岛素抵抗模型组细胞内GLUT-4表达显著降低(P0.01);与模型组相比,DSG组、5-MOP组、DSG/5-MOP组和β-Estradiol组GLUT-4表达显著增加(P0.01,P0.05);与5-MOP组相比,DSG/5-MOP组GLUT-4表达显著降低(P0.05)。结论胡芦巴丸中的活性组分DSG和5-MOP可能通过ERα介导的PI3K/Akt信号通路激活而改善胰岛素抵抗。第二部分从AMPK/ACC/CPT-1A信号通路探讨胡芦巴丸活性组分改善LO2细胞脂代谢紊乱的机理研究目的比较不同浓度DSG(10-5mol/L、10-6mol/L、10-7mol/L)对正常人肝细胞(LO2)内脂肪沉积的影响,并探索其相关分子机制。方法用含0.25mmol/L棕榈酸(PA)的DMEM高糖完全培养基干预LO2细胞24h,建立高糖高脂诱导的非酒精性脂肪肝的细胞模型;根据所给予相应的药物干预,分为低剂量 DSG 组(10-7mol/L)、中剂量 DSG 组(10-6mol/L)、高剂量 DSG 组(10-5 mol/L)、A-769662组(AMPK激活剂,10-5 mol/L),另设模型组和对照组。荧光测定细胞内活性氧(ROS)含量、线粒体膜电位(MMP)、培养液中葡萄糖消耗;酶法检测细胞内甘油三酯(TG)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、丙二醛(MDA)含量,细胞上清液谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、γ-谷氨酰基转移酶(γ-GT)含量;Western Blot检测细胞内腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)、乙酰辅酶A羧化酶(ACC)的磷酸化蛋白/总蛋白表达水平,细胞内脂肪酸合成酶(FAS)、肉毒碱棕榈酰转移酶-1A(CPT-1A)、固醇调控元件结合蛋白-1c(SREBP-1c)的蛋白表达水平,胞浆细胞色素c(cyc)含量。此外,用AMPK抑制剂Compound C(10-5mol/L)预刺激细胞5h后再给予相应的药物干预,Western Blot检测AMPK,ACC的磷酸化蛋白/总蛋白表达水平。结果与对照组相比,ROS在非酒精性脂肪肝细胞模型组细胞内含量升高;与模型组相比,低剂量DSG组、中剂量DSG组、高剂量DSG组、A-769662组ROS含量降低。与对照组相比,非酒精性脂肪肝细胞模型组细胞MMP显著降低(P0.01)、细胞上清葡萄糖消耗显著减少(P0.01);与模型组相比,低剂量DSG组、中剂量DSG组、高剂量DSG组、A-769662组细胞MMP显著升高(P0.01)、细胞上清葡萄糖消耗显著升高(P0.01,P0.05)。与对照组相比,TG、ALT、AST、y-GT在非酒精性脂肪肝细胞模型组细胞中显著升高(P0.01);与模型组相比,低剂量DSG组、中剂量DSG组、高剂量DSG组、A-769662组细胞TG、ALT、AST、γ-GT显著降低(P0.01,P0.05)。与对照组相比,GSH-PX、SOD、CAT含量在模型组细胞内显著降低(P0.01);与模型组相比,低剂量DSG组、中剂量DSG组、高剂量DSG组、A-769662组细胞内GSH-PX、SOD、CAT含量显著升高(P0.01)。与对照组相比,模型组细胞内MDA含量显著升高(P0.01);与模型组相比,低剂量DSG组、中剂量DSG组、高剂量DSG组、A-769662组细胞内MDA含量显著降低(P0.01)。与对照组相比,p-AMPK/AMPK、p-ACC/ACC、CPT-1A/β-actin表达量在非酒精性脂肪肝细胞模型组细胞内显著降低(P0.01,P0.05);与模型组相比,低剂量DSG组(CPT-1A/β-actin无显著性)、中剂量DSG组、高剂量DSG组、A-769662组细胞内 p-AMPK/AMPK、p-ACC/ACC、CPT-1A/β-actin 表达量显著升高(P0.01,P0.05)。与对照组相比,细胞内FAS/β-actin、SREBP-1c/β-actin表达量和胞浆中cyc/β-actin含量在非酒精性脂肪肝细胞模型组显著升高(P0.01);与模型组相比,低剂量DSG组、中剂量DSG组、高剂量DSG组、A-769662组细胞内FAS/β-actin、SREBP-1c/β-actin表达量和胞浆中cyc/β-actin含量显著降低(P0.01,P0.05)。与DSG 组(10-5 mol/L)细胞相比,Compound C/DSG 组(10-5mol/L Compound C + 10-5mol/L DSG)细胞 p-AMPK/AMPK、p-ACC/ACC 表达量显著降低(P0.01)。结论胡芦巴丸中的活性组分DSG可以改善高糖高脂诱导的L02细胞内脂质沉积。其机制可能与激活AMPK/ACC/CPT-1A信号通路、增加脂质分解、减少脂质合成、改善氧化应激损伤有关。
【图文】：

ＨｑｐＧ２细胞肤岛素抵抗模型的建立逡逑用ＲＰＭＩ－１６４０培养基的含糖量减去细胞上清液中所测得的葡萄糖含量即为细胞逡逑上清葡萄糖消耗量，，如图１－１所示，当族岛素浓度为ｌ0－６ｍｏｌ／Ｌ时，细胞上清中葡萄逡逑糖消耗明显低于对照沮，差异有统计学意义。故选取１０－６ｍｏＩ／Ｌ的膜岛素作为最适宜逡逑造模浓度。逡逑０．６－｜逡逑

本文编号：2677693