麦芽“炒香”对成分含量及其肠吸收的影响研究

发布时间：2020-05-27 07:13

【摘要】：麦芽是常见的一味消食药,一直沿用“炒黄炒香”入药的传统,与生麦芽比较,炒麦芽的“消食化滞”作用更强;目前,麦芽“炒香”工艺多以消化酶、黄酮类成分为评价指标。而现代研究发现,麦芽炒香过程中,消化酶由于热的影响,其活性必然下降;同时,黄酮类成分与“炒香”也缺乏必然联系。麦芽中含有还原糖、氨基酸等传统意义上的“无效成分”,炒制过程中可能发生Maillard反应,而产生具有“香味”的Maillard反应产物MRPs。因此,麦芽“炒香”工艺可能与还原糖、氨基酸、MRPs等传统意义上的“无效成分”之间更具相关性。中医理论认为,麦芽“炒香”后可达到“醒脾”的效果,即“炒香醒脾”。“脾主运化”,在一定程度上,“炒香醒脾”可认为是香味物质恢复脾脏运化升清功能,进而促进了营养成分、药效成分的吸收。本项目通过考察麦芽“炒香”过程中,还原糖、氨基酸、丙烯酰胺、MRPs、5-HMF等传统意义上的“无效成分”,以及麦黄酮、阿魏酸、儿茶素、槲皮素、山奈酚等“有效成分”的含量变化规律,采用HCA(Hierarchical cluster analysis,HCA)及PLS-DA(partial least squares-discriiminate analysis,PLS-DA)方法,评价麦芽“炒香”工艺,确定炒制终点;在此基础上,采用离体、在体、整体动物模型,研究“炒香”对有效成分肠吸收的影响,进一步从MRPs促进阿魏酸、儿茶素、槲皮素、山奈酚等有效成分肠吸收的角度,探讨“炒香醒脾”的作用机理。主要研究内容如下:1麦芽“炒香”对成分的影响采用HPLC测定麦黄酮、槲皮素、山奈酚、儿茶素、阿魏酸、5-HMF及丙烯酰胺的含量;采用HPLC-ELSD测定D-葡萄糖、蔗糖、D-果糖及D-麦芽糖的含量;采用PITC柱前衍生-HPLC测定炒制过程中苏氨酸(Thr),丙氨酸(Ala),甘氨酸(Gly),组氨酸(His),异亮氨酸(Ile),精氨酸(Arg),γ-氨基丁酸(γ-GABA),酪氨酸(Tyr),缬氨酸(Val),脯氨酸(Pro),蛋氨酸(Met),苯丙氨酸(Phe),色氨酸(Trp),亮氨酸(Leu),赖氨酸(Lys)15种氨基酸的含量。研究炒制温度、炒制时间对“有效成分”(麦黄酮、槲皮素、山奈酚、儿茶素、阿魏酸)、Maillard反应物(糖类、氨基酸)及Maillard反应产物(5-HMF、丙烯酰胺、A420)含量的影响,并采用HCA及PLS-DA,阐明炒制过程中各成分的动态变化规律,确定炒制终点。炒制温度对有效成分的影响结果显示,麦黄酮、槲皮素、山奈酚、儿茶素、阿魏酸等5种成分随炒制温度升高,含量变化不明显。炒制温度对Maillard反应物糖、氨基酸的影响结果显示,D-果糖、D-麦芽糖、D-葡萄糖等还原糖及氨基酸的量随温度增加整体表现为下降趋势,而非还原糖蔗糖则表现为先升高后降低。炒制温度对Maillard反产物5-HMF、丙烯酰胺、A420的影响结果显示,当炒制温度在120℃以下时,均不产生5-HMF、丙烯酰胺,温度大于140℃时,5-HMF、丙烯酰胺、A420缓慢增加,当到达一定温度时,迅速增加至最大值后到达稳态。以上结果表明,炒香对传统意义上“有效成分”影响较小,而对Maillard反应物及产物等“无效成分”影响较大。进一步采用聚类分析结果表明,麦芽炒制温度可分为为生麦芽及90-140℃,160-180℃,200-220℃,240-260℃四类,PLS-DA分析表明,在炒制过程中蔗糖及Maillard反应产物5-HMF、丙烯酰胺、A420的VIP(Variable importance,VIP)值较大,对区分麦芽不同炒制温度样品具有显著的贡献率,而“有效成分”及Maillard反应物的贡献率均较小。根据聚类结果及具有较大VIP贡献率成分的药理作用,并结合炒麦芽的颜色、香味,确定220℃为最佳炒制温度。炒制时间对有效成分含量影响结果显示,麦黄酮、槲皮素、山奈酚、儿茶素、阿魏酸等5种成分随炒制时间延长,含量变化亦不明显。炒制温度对Maillard反应物糖、氨基酸的影响结果显示,随炒制时间的延长,4种糖及氨基酸的量均呈降低趋势,糖类含量在16 min后基本不再变化,氨基酸在8 min后含量基本保持不变。炒制温度对Maillard反产物5-HMF、丙烯酰胺、A420的影响结果显示,在0-18min之间,5-HMF及A420随着炒制时间的增加,其含量不断增加至最大值后基本保持不变,当炒制时间在20 min后,开始产生丙烯酰胺且逐渐增加。以上结果进一步表明,炒香对传统意义上“有效成分”影响较小,而对“无效成分”影响较大。聚类分析结果表明,13个不同炒制时间样品可分为生麦芽,2-4min,6 min,8-14 min,16-26 min五类,根据5-HMF,丙烯酰胺及类黑素的药理作用,选16-18 min为炒制最佳时间。2麦芽“炒香”对有效成分肠吸收的影响2.1离体模型采用离体外翻肠囊模型,应用HPLC测定生麦芽(阿魏酸、儿茶素、山奈酚、槲皮素+3种还原糖+15种氨基酸)及炒麦芽(阿魏酸、儿茶素、山奈酚、槲皮素+MRPs)肠囊液中阿魏酸、儿茶素、山奈酚、槲皮素的含量,考察“炒香”对4种成分肠吸收的影响。结果表明,4种成分在大鼠不同肠段均有吸收;与生麦芽比较,炒麦芽中槲皮素、山奈酚的Ka与Papp在十二指肠、空肠、回肠等三个肠段均明显增加(p0.05);与生麦芽比较,炒麦芽中儿茶素的Ka与Papp在十二指肠与空肠亦显著增加(p0.05);与生麦芽比较,炒麦芽组阿魏酸在回肠中Ka与Papp明显增加(p0.05)。以上结果表明,“炒香”能在一定程度上促进有效成分在小肠中的吸收。2.2在体模型采用在体单向肠灌流模型,建立肠灌液中阿魏酸、儿茶素、山奈酚、槲皮素的HPLC测定方法,考察“炒香”对麦芽中4种有效成分的影响。结果表明,与生麦芽比较,炒麦芽中儿茶素、山奈酚与槲皮素的Ka与Papp在十二指肠、空肠、回肠三个肠段均显著增加(p0.05),阿魏酸在十二指肠与空肠的Ka与Papp显著增加(p0.05)。结果进一步表明,麦芽“炒香”能促进有效成分的肠吸收;综合比较Ka、Papp的大小,阿魏酸、儿茶素、山奈酚、槲皮素在十二指肠中吸收较好。2.3整体动物模型采用整体动物模型,应用HPLC-MS/MS测定血浆中阿魏酸、儿茶素、山奈酚、槲皮素的含量,绘制浓度-时间曲线,比较Ka、AUC_(0-t)、C_(max)等药动学参数,考察“炒香”对麦芽中4种有效成分药动学的影响。结果表明,与生麦芽比较,炒麦芽中儿茶素、阿魏酸、槲皮素及山奈酚的Ka、AUC_(0-t)及C_(max)均显著增加(p0.05)。结果再次表明,“炒香”能促进麦芽有效成分的吸收。3麦芽中有效成分肠吸收机理研究3.1浓度及维拉帕米、EDTA、甘露醇对有效成分的肠吸收影响采用在体单向肠灌流模型,考察阿魏酸、儿茶素、山奈酚及槲皮素在小肠中的吸收机制。结果山奈酚、槲皮素的Ka、Papp随浓度增加,未出现明显变化,表明山奈酚、槲皮素的肠吸收机制为被动转运。与中浓度比较,低浓度儿茶素、阿魏酸的Ka、Papp无显著变化,但随着浓度的进一步增加,儿茶素、阿魏酸的Ka、Papp显著减少(p0.05),提示儿茶素、阿魏酸的吸收存在饱和现象,转运过程中可能有载体的参与。加入维拉帕米及甘露醇后,阿魏酸、儿茶素、山奈酚、槲皮素等4种成分的Ka与Papp无显著变化,表明阿魏酸、儿茶素、山奈酚、槲皮素等4种成分不是P-gp蛋白及SGLT的底物;加入EDTA后,儿茶素、槲皮素、山奈酚的Ka与Papp显著增加(p0.05),表明儿茶素、山奈酚、槲皮素等3种成分的吸收可能与紧密连接蛋白有关。3.2麦芽“炒香”对紧密连接蛋白表达的影响基于紧密连接蛋白介导儿茶素、山奈酚、槲皮素的肠吸收,进一步采用Western blot及q-PCR方法,考察“炒香”对十二指肠中紧密连接蛋白Claudin-1及ZO-1表达的影响。Western blot结果显示,与对照组比较,生麦芽组的紧密连接蛋白ZO-1及Claudin-1表达无明显变化;与生麦芽比较,炒麦芽及MRPs中的ZO-1及Claudin-1蛋白表达明显降低(p0.05)。q-PCR结果显示,与对照组比较,生麦芽组中紧密连接蛋白ZO-1及Claudin-1 mRNA的表达无明显变化;与生麦芽组比较,在炒麦芽及MRPs组中,ZO-1及Claudin-1 mRNA的表达均显著降低(p0.05)。以上结果表明,麦芽“炒香”可“下调”紧密连接蛋白的表达,提高旁路吸收效率,促进肠吸收,且这种作用可能与MRPs有关。本项目研究结果表明,麦芽“炒香”对“无效成分”影响较大,而对“有效成分”影响较小,因此,以Maillard反应产物5-HMF、丙烯酰胺及A420等传统意义上“无效成分”作为“炒香”工艺的评价指标,确定炒制终点,为中药炒制工艺研究提供新的视角。同时,麦芽“炒香”后形成的MRPs能促进“有效成分”的肠吸收,这可能是麦芽炒香“醒脾”的作用机制之一。本项目从Maillard的角度,研究麦芽“炒香”工艺,阐明“炒香醒脾”的作用机理,为中药炮制工艺及传统中医药理论研究提供新思路。
【图文】：

光谱图,儿茶素,阿魏酸,长扫描

注：A5-HMF B 儿茶素 C 阿魏酸图 1 5-HMF、儿茶素、阿魏酸全波长扫描光谱图he full-wavelength scanning spectrum of 5-HMF, Catechin, Fe件的建立il 100-5 C18(4.6 mmx250 mm，5 μm)色谱柱，流动相为甲醇用梯度洗脱：0～20 min，2%～2%A，20～60 min，2%～法，检测波长：0~13min，，283 nm，13~17 min，320 nm，160 min，320 nm；进样量为 20 μL；流速 0.8 mL/min；柱温及混合对照品的制备F、阿魏酸、儿茶素对照品，分别精密称定 4.5 mg、18.8 mg定容至 25 mL，得浓度为 0.180 mg/mL、0.752 mg/mL、0.6阿魏酸、儿茶素对照品储备液。量取上述对照品储备液 5-HMF500 μL、儿茶素 500 μL、阿

光谱图,麦黄酮,山奈酚,槲皮素

13注：A 槲皮素 B 麦黄酮 C 山奈酚图 2 槲皮素、麦黄酮、山奈酚全波长扫描光谱图ull-wavelength scanning spectrum of Quercetin, Flavonoids, Ka件asil 100-5 C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色谱柱，流动相为（B），采用梯度洗脱：0 ～ 60 min，20% ～ 35%A，6000%A；检测波长为 345 nm；进样量 20 μL；流速 0.8 mL/m和混合对照品的制备素、麦黄酮、山奈酚对照品，分别精密称定 24 mg、3.7 mg，定容至 25 mL，得浓度为 0.960 mg/mL、0.148 mg/mL、0
【学位授予单位】：江西中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R283;R285.5

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