青藤碱上调microRNA-124对小鼠肾缺血再灌注损伤保护效应的研究

发布时间：2020-05-31 18:12

【摘要】：目的:青藤碱是从防己科植物青藤等植物中提取的生物碱,具有镇痛、镇咳、局麻、免疫抑制、抗炎和抗肿瘤等作用,近年来发现青藤碱也具有缺血再灌注损伤的保护功效。本课题通过建立小鼠肾缺血再灌注模型,从肾功能、氧化应激、细胞凋亡和microRNA的调节等方面,研究青藤碱对缺血再灌注肾脏保护的机制。方法:建立小鼠肾缺血再灌注模型,于再灌注前1h小鼠腹腔注射青藤碱(sinomenine,SIN)(200 mg/kg),假手术组(Sham)和缺血再灌注组(I/R)腹腔注射等容量生理盐水。全自动生化仪检测小鼠血清Cr和BUN浓度;应用黄嘌呤氧化酶法测定小鼠肾组织SOD活性;髓过氧化酶法测定小鼠肾组织MPO活性;硫代巴比妥法测定小鼠肾组织MDA含量;应用脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法检测肾组织细胞凋亡。矿物油覆盖细胞法建立HK-2细胞缺氧/复氧(hypoxia/reoxygenation,H/R)细胞模型。MTT法检测青藤碱处理HK-2细胞H/R后的活性,流式细胞仪检测不同浓度青藤碱处理HK-2细胞H/R后的凋亡。根据文献确立miR-21、miR-320、miR-124、miR-92a、miR-29和miR-378为候选miRNA,通过实时定量PCR检测HK-2细胞H/R后这些miRNA的表达。利用TargetScan对miR-124靶基因进行分析预测,通过双荧光素酶报告基因检测法检测miR-124与靶基因Caspase-9的结合。Westblot检测miR-124 mimic与inhibitor转染HK-2细胞,HK-2细胞H/R后Caspase-9的表达。结果:1.与Sham组比较,I/R组和SIN组在肾缺血再灌注8h和24h时,血清Cr和BUN浓度均升高,差异有统计学意义(P0.01);与I/R组比较,SIN+I/R组在肾缺血再灌注8h和24h时血清Cr和BUN浓度均降低,差异有统计学意义(P0.01)。2.与Sham组比较,I/R组和SIN组在肾缺血再灌注8h和24h时,肾脏组织细胞凋亡率、MDA浓度与MPO活性均升高,而SOD活性降低,差异有统计学意义(P0.01);与I/R组比较,SIN+I/R组在缺血再灌注8h和24h时肾脏组织细胞凋亡率、MDA浓度与MPO活性均降低,而SOD活性升高,差异有统计学意义(P0.05)。3.与H/R 24h HK-2细胞对照组比较,各浓度的SIN+H/R组HK-2细胞活性均升高,细胞凋亡率降低,差异有统计学意义(P0.05)。4.HK-2细胞H/R 24h后的miR-21、mi R-29和miR-378的表达上调,miR-320、miR-124和miR-92a表达下调,与对照组比较,miR-378表达明显上调,而miR-124表达明显下调,差异有统计学意义(P0.05)。H/R导致HK-2细胞miR-124表达随着H/R时间延长,miR-124表达逐渐降低,与对照组比较差异有统计学意义(P0.05)。5.当用青藤碱处理H/R的HK-2细胞,HK-2细胞的miR-124表达会随着药物浓度的增大而上升;与H/R对照组比较,除0.1μM浓度外,其它浓度的SIN+H/R组24h的HK-2细胞的miR-124表达上调,差异有统计学意义(P0.05)。6.当miR-124 mimic转染HK-2细胞后,与NC比较,miR-124表达明显升高,而inhibitor转染HK-2细胞后,与NC比较,miR-124表达明显降低,差异有统计学意义(P0.01)。7.与对照组比较,pGL 3’-WT Caspase 9 3’-UTR+miR-124 mimic组Caspase 9表达很低,差异有统计学意义(P0.01),而pGL 3’-WT Caspase 9 3’-UTR+miR-124inhibitor组Caspase 9表达明显升高,差异有统计学意义(P0.01),与对照组比较,Mut Caspase 9 3’-UTR各组Caspase 9表达无明显变化,差异无统计学意义(P≥0.05)。8.与对照组比较,当HK-2细胞转染miR-124 mimic后,Caspase-9表达显著减少,差异有统计学意义(P0.01);而当HK-2细胞转染miR-124 inhibitor后,与对照组比较,Caspase-9表达显著增多,差异有统计学意义(P0.01)。9.青藤碱(50μM)能提高H/R HK-2细胞活性而降低细胞凋亡率,但当miR-124 inhibitor抑制HK-2细胞miR-124表达后,SIN+mi R-124 inhibitor组H/R HK-2细胞活性降低,细胞凋亡率明显升高。与SIN组比较,SIN+miR-124 inhibitor组H/R 24h后HK-2细胞活性明显降低而细胞凋亡率升高,差异有统计学意义(P0.01)。结论:青藤碱可减轻小鼠肾缺血再灌注的组织损伤,其机制与青藤碱抑制氧化损伤和降低肾脏细胞凋亡率有关。H/R后的HK-2细胞的miR-124表达明显下调,说明miR-124与HK-2细胞H/R有关。miR-124通过与Caspase 9 3’-UTR结合,从而下调Caspase-9的表达,抑制细胞凋亡的进程。青藤碱可减轻缺氧/复氧后HK-2细胞的损伤,其机制与青藤碱诱导miR-124的上调,抑制细胞凋亡的进程有关。
【学位授予单位】：兰州大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R285.5

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本文编号：2690260