芒果苷和鱼腥草素钠协同氟康唑抗耐药白念珠菌作用研究

发布时间：2020-06-10 17:15

【摘要】：白念珠菌是一类普遍的寄生真菌,过度繁殖可以导致人体浅表皮肤、粘膜感染,严重时可引起肺炎、脑膜炎等深部感染。国内外文献报道白念珠菌对氟康唑的耐药性不断增强,耐药白念珠菌严重威胁人体健康。因此,研究新型抗耐药白念珠菌的药物具有重大临床意义。植物中分离出的天然产物来源广泛,结构简单,毒性低,活性强,对研发新型药物具有重要意义。本课题基于前期实验发现,天然化合物芒果苷和鱼腥草素钠单独作用都具有一定抗菌活性,但抑菌浓度太高。因此,本课题重点研究芒果苷和鱼腥草素钠在较低浓度下协同氟康唑抗耐药白念珠菌的作用,并对机制进行探索。本研究第一部分探索了芒果苷与氟康唑联用抗耐药白念珠菌的作用和机制。实验首先采用科玛嘉显色培养基对实验室的24株临床白念珠菌进行鉴定,确保实验可靠性。应用棋盘式微量稀释法、生长抑制实验、时间-生长曲线实验、时间-杀菌曲线实验进行多次重复验证,确定芒果苷与氟康唑合用对耐药白念珠菌抑制作用的普遍性和广泛性。通过建立小鼠系统性真菌感染模型,研究氟康唑和芒果苷联用体内抗菌药效,结果表明两药合用不能明显提高生存率,但可以延长模型小鼠的平均生存天数。本课题进一步real-time RT-PCR方法,研究芒果苷与氟康唑协同抗菌的作用机制。结果显示,,两药合用使耐药基因表达水平下调,CDR1下调幅度最大。提示芒果苷协同氟康唑抗耐药白念珠菌分子机制可能与抑制耐药蛋白(Cdr1p、Cdr2p、Mdr1p)转运功能,迫使白念珠菌对药物的敏感性升高有关。本课题第二部分探究鱼腥草素钠与氟康唑联用抗耐药白念珠菌的作用和机制。本研究首先应用棋盘式微量稀释法证明鱼腥草素钠与唑类抗菌药物具有协同抗菌活性,进一步应用纸片扩散实验法、棋盘式微量稀释法、时间-生长曲线实验、时间-杀菌曲线实验,研究鱼腥草素钠与氟康唑合用对浮游白念珠菌的抑制作用。结果表明,两药合用对白念珠菌具有明显抑制作用和杀菌作用。实验进一步通过菌丝抑制实验、XTT法测定被膜形成率实验、荧光显微镜观察被膜和相对疏水性实验研究了鱼腥草素钠与氟康唑合用对被模型白念珠菌的抑制作用。结果显示,两药合用可以明显抑制菌丝形成、降低被膜形成率、降低细胞表面疏水性,抑菌药效和药物作用浓度呈正比。实验进一步通过建立小鼠系统性真菌感染模型、大鼠体内生物被膜模型,探究两药联合抗体内系统性真菌感染和抗生物被膜形成的作用。结果显示,鱼腥草素钠与氟康唑联用可以有效降低系统性真菌感染小鼠死亡率,延长生存天数,并能够抑制体内菌丝和生物被膜形成。课题进一步对鱼腥草素钠协同氟康唑抑菌的机制进行了实验探索。通过活性氧实验、胞内ATP水平测定,表明药物协同机制或与降低细胞代谢水平,抑制ATP产生有关。采用免疫荧光法观察实验药物联用前后对细胞壁成分的影响,结果发现,两药合用后细胞体积变大,呈“串珠”状,且细胞壁中葡聚糖暴露荧光减弱。流式细胞仪检测结果显示8μg/m L鱼腥草素钠与4μg/mL氟康唑合用后,84.46%细胞丧失了选择通透能力。本研究最后采用real time RT-PCR方法检测两药合用对耐药基因表达水平的影响。结果显示,两药合用可选择性抑制药物耐药基因CDR1、CDR2、MDR1、FLU1表达。因此,鱼腥草素钠和氟康唑协同抗耐药白念珠菌机制作用可能与降低细胞代谢水平、降低耐药基因表达水平、破坏细胞壁和使细胞膜丧失选择通透能力有关。本课题第三部分通过同位素标记相对和绝对定量方法(iTRAQ)研究鱼腥草素钠协同氟康唑抗白念珠菌机制,通过iTRAQ方法共鉴定出2333个蛋白质,两药合用组共检测出150个可信差异蛋白,排除氟康唑、鱼腥草素钠单独作用差异蛋白,经数据库对比分析发现有34个蛋白质已确定生物学功能。对差异蛋白分类进行生物学功能分析,发现两药合用使能量代谢蛋白表达升高(ACO1p、HXK2p、KGD1p、ACS2p),催化β-1,3葡聚糖合成蛋白(FKS1p)表达降低,促进β-1,3葡聚糖分解蛋白(XOG1p、ENG1p)升高,提示两药协同抗白念珠菌作用机制可能与调节β-1,3葡聚糖合成分解、破坏细胞壁完整性有关。
【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R285

【参考文献】