表告依春降低流感“易感性”的作用和机制研究

发布时间：2020-06-13 12:26

【摘要】：实验目的:甲型流感病毒是一种具有高度传染性的人畜共患病原体,并能引起严重的呼吸系统感染疾病,甚至死亡。由于流感病毒变异速度迅速,耐药株出现频率高,故目前尚缺乏理想的抗病毒西药和疫苗,而作为来源广泛,毒副作用小且多靶点天然中药产物,具有良好的抗病毒作用,成为近年来医学研究的热点。表告依春是从中药板蓝根中分离出来的一种生物碱类化合物,研究发现表告依春体外具有一定的抗病毒、抗氧化、抗炎的作用,且体内生物利用度良好,但其体内药效作用和机制仍未阐明。因此,本课题采用了应激负荷的流感“易感”小鼠模型对表告依春抗流感的体内药效进行了有效评价,并采用CORT负荷A549细胞模型对其作用机制进行深入研究,旨为表告依春的临床应用和开发提供有益的理论和实验依据,并进一步阐明传统中医药在抗病毒作用机理。实验方法:本论文探究了表告依春对应激负荷小鼠感染流感病毒易感性的影响。动物实验研究方案如下,KM小鼠随机分成6组,包括正常对照组(Normal)、病毒感染组(Virus)、应激负荷+病毒组(Stress+Virus)、奥司他韦组(Oseltamivir+Stress+Virus)、表告依春低剂量组(Epigoitrin-L+Stress+Virus)、表告依春高剂量组(Epigoitrin-H+Stress+Virus)。其中,奥司他韦组、表告依春低浓度组、表告依春高浓度组的给药剂量分别为30 mg/kg/day、2.5mg/kg/day、5 mg/kg/day。各给药组的小鼠连续7天灌服对应剂量的药物,其他组则灌服等量的0.9%氯化钠溶液。给药的当天,各组小鼠被施加应激拘束负荷,持续时间为22 h(正常对照组、病毒感染组除外),在此期间所有小鼠禁水禁食。拘束完成后第2天,将各组小鼠置于乙醚麻醉,正常对照组除外,每只小鼠给予35μL的PBS病毒悬液(2×LD_(50))感染流感病毒。接下来连续观察21天,观察小鼠发病、死亡的相关情况,并每日进行记录。其中,若小鼠出现如食欲下降、弓背、呼吸改变、褶毛、运动迟缓、感知变弱等流感表征时即为发病。对上述记录观察进行统计分析。其次,研究表告依春对应激负荷小鼠感染流感病毒继发性肺炎的影响并探讨表告依春抗流感病毒降低病毒易感性的机制研究。具体实验方法如下,(1)将已适应性饲养的另一批实验小鼠随机分为六个组别,即应激负荷+病毒组(Stress+Virus)、奥司他韦组(Oseltamivir+Stress+Virus)、表告依春低剂量组(Epigoitrin-L+Stress+Virus)、表告依春高剂量组(Epigoitrin-H+Stress+Virus)、正常对照组(Normal)、病毒感染组(Virus)。各组小鼠给药、给予拘束应激负荷和感染流感病毒等处理一致,感染病毒第五天,称重并记录,后乙醚麻醉处死,收集小鼠肺脏组织用分析天平秤重、肉眼观察、相机拍照。取部分肺组织固定后进行HE染色、拍片,取部分肺组织进行蛋白裂解后,利用western blotting检测各组炎症因子白介素1-β(IL1-β)、肿瘤坏死因子(TNF-α)的蛋白表达。(2)实验分组及处理如上所示,小鼠感染流感病毒后第5天,处死,收集小鼠肺组织,用Western blotting检查肺脏组织中的IFN-β、IFITM3、Mfn2、MAVS的蛋白表达水平。最后,采用CORT负荷A549细胞模型验证表告依春的抗病毒作用机制。用MTT法筛选出表告依春在CORT负荷A549细胞适合的给药量。为验证表告依春对CORT负荷A549细胞感染流感病毒的影响,根据实验需要,将细胞随机分为以下六组,分别为正常对照组(Normal)、病毒感染组(Virus)、皮质酮组(CORT)、模型组(CORT+Virus)、表告依春+病毒组(Epigoitrin+Virus)、表告依春模型组(Epigoitrin+CORT+Virus)。表告依春预保护细胞2 h,随后100μM CORT负荷2天,PBS洗3遍后,以10 TCID_(50)流感病毒稀释液浸染对应组别的A549细胞1 h,洗去病毒稀释液后再培养8 h。收集细胞,检测NP、Mfn2、MAVS、IFITM3、p-IRF3、NF-κB的基因或蛋白表达水平。实验结果:(1)研究结果显示,表告依春能提高应激负荷小鼠的生存率和健康率,降低应激负荷小鼠感染H1N1流感病毒后的死亡率、发病率,提示表告依春对H1N1流感病毒感染的应激负荷小鼠有良好的保护作用。(2)通过对小鼠肺脏组织重量、外观、HE染色切片、检测肺部组织蛋白水平表达等观察表明,表告依春能够降低感染H1N1应激负荷小鼠的肺指数,降低由流感病毒诱发的肺水肿程度及肺脏组织损伤水平,下调肺组织中炎症因子IL1-β、TNF-α的蛋白分泌水平表达,使病变组织炎症减轻,起到了改善继发性肺炎的作用。(3)表告依春能够上调感染流感病毒的拘束应激负荷小鼠肺组织中的MAVS蛋白水平,下调Mfn2水平,增加IFN-β及IFITM3水平表达,促进干扰素效应,表明表告依春通过调节MAVS信号通路的相关蛋白表达水平从而发挥降低H1N1易感性的作用。(4)在CORT负荷的A549细胞模型中,表告依春能够减少NP的表达水平,进一步研究发现,表告依春能增加MAVS表达,下调Mfn2表达,促进IRF-3磷酸化,下调NF-κB,增加IFITM3蛋白表达。研究结论:表告依春能通过降低感染病毒小鼠肺部组织中炎症因子的表达,明显改善继发性肺炎的症状,降低病毒感染易感小鼠的发病率,从而提高小鼠生存率。这与其介导线粒体融合蛋白Mfn2增强MAVS固有免疫信号通路的响应密切相关。表告依春能通过Mfn2-MAVS信号通路发挥抗病毒作用,改善拘束应激引起的流感易感性。
【图文】：

机制,流感病毒,疾病易感性,小鼠

活性成分——表告依春的抗流感病毒作用。研究结果表明激负荷小鼠及 CORT 细胞流感病毒易感性。显示，在拘束应激小鼠模型中，表告依春能够延长小鼠病毒的发病率及死亡率；HE 染色表明表告依春同时能明肺损伤，降低炎症因子如 TNF- 、IL-1β 的产生从而降低研究发现，Mfn2 作为线粒体融合蛋白 2，，与流感病毒易够通过抑制 MAVS 聚集从而削弱固有免疫反应响应程度告依春的作用机制后，我们发现在体内和细胞模型中（如依春组均能明显降低 Mfn2 的表达，促进 MAVS 蛋白水抗病毒通路作用中的信号传导，进一步使干扰素分泌增的清除；同时表告依春也会使 MAVS 通路激活 IKKε 使促炎因子的分泌，降低疾病易感性。
【学位授予单位】：暨南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R285.5

【参考文献】