【摘要】：糖尿病肾病(Diabetic nephropathy,DN)是糖尿病(Diabetes mellitus,DM)最常见的微血管并发症之一。随着DN的进展,患者将最终发展为终末期肾病(End-stage renal disease,ESRD)。在世界范围内,DN已成为ESRD的首要致病因素。肾小球系膜细胞(Mesangial cells,MCs)细胞外基质分泌增多引起的肾小球纤维化是DN进展的重要病理特征之一。在纤维化的过程中转化生长因子-β1(Transforming growth factor-β1,TGF-β1)/Smad信号通路活化,促进MCs分泌胶原IV(Collagen IV,Col4)以及黏连蛋白(Fibronectin,FN)被认为是DN纤维化的核心机制。除高血糖外,游离脂肪酸(Free fatty acids,FFAs)的升高被认为是DN的危险因素之一:FFAs可导致足细胞凋亡及MCs纤维化的发生。分化抗原簇36(Cluster of differentiation 36,CD36)介导的FFAs吸收增多是FFAs引起细胞损伤的主要机制之一。此外有报道指出瞬时受体电位阳离子通道6(Transient receptor potential cation channel 6,TRPC6)的激活与肾纤维化密切相关。因此DN时,FFAs引起的肾小球纤维化可能与CD36介导FFAs吸收增多,并进一步激活TRPC6及其下游转录因子活化T细胞核因子2(Nuclear factor of activated T cell 2,NFAT2)有关。黄芪甲苷(Astragalosides IV,AS-IV)是中药黄芪的主要活性成分,具有抗炎、抗氧化等多种药理活性。课题组前期实验已证实AS-IV对1型DN大鼠以及高糖刺激MCs的保护作用。而AS-IV对2型DN大鼠及FFAs刺激MCs引起的纤维化是否具有保护作用仍不明确。本研究旨在探讨FFAs引起系膜细胞纤维化的相关机制以及AS-IV的保护作用。第一部分基于CD36/TRPC6/NFAT2探讨棕榈酸钠介导糖尿病肾病肾小球纤维化的机制目的:棕榈酸钠(Palmitate,PA)刺激人肾小球系膜细胞(Human glomerular mesangial cells,HMCs)体外模型中探讨CD36/TRPC6/NFAT2信号通路对纤维化的调控机制。并在高脂饮食(High fat diet,HFD)联合低剂量链脲佐菌素(Streptozotocin,STZ)诱导的2型DN大鼠模型中做初步验证。方法:1.PA(200μM)刺激HMCs作为模型组,正常对照组含有等量牛血清白蛋白(Bovine serum albumin,BSA),具体分组如下:1.1正常培养HMCs分为(1)正常对照组,(2)PA 2h组,(3)PA 6h组,(4)PA 12h组,(5)PA 24h组。蛋白免疫印记(Western blotting)检测TGF-β1、p-Smad2/3、FN、胶原IVα1链(Collagen Type IV Alpha 1 Chain,Col4A1),CD36及TRPC6蛋白表达。Western blotting及免疫荧光(Immunofluorescence,IF)法检测NFAT2蛋白表达。油红染色观察细胞内脂质沉积情况。1.2正常培养的HMCs分为:(1)正常对照组,(2)PA 0.5h组,(3)PA 2h组,(4)PA 6h组。荧光显微镜检测各时间点细胞内Ca2+水平。流式细胞法检测PA刺激6h后细胞内Ca2+水平。1.3正常培养的HMCs分为:(1)正常对照组,(2)PA 6h组,(3)PA 6h+SKF96365组,(4)氟灭酸(Flufenamic acid,FA)组,(4)PA 6h+FA组,(5)磺基-N-琥珀酰亚胺基油酸酯(Sulfo-N-succinimidyl oleate,SSO),(6)PA 6h+SSO,(7)PA 6h+CD36si RNA组。荧光显微镜检测细胞内Ca2+水平。1.4正常培养的HMCs分为:(1)正常对照组,(2)PA 24h组,(3)PA 24h+SKF96365组,(4)FA组,(5)PA 24h+FA组。Western blotting法检测TGF-β1、p-Smad2/3、FN、Col4A1、TRPC6及NFAT2蛋白表达。1.5正常培养的HMCs分为:(1)正常对照组,(2)PA 24h组。IF检测FN、NFAT2;CD36、NFAT2共表达情况。1.6正常培养的HMCs分为:(1)正常对照组,(2)PA 24h组,(3)PA 24h+NFAT2si RNA组。Western blotting法检测TGF-β1、p-Smad2/3、FN及Col4A1的表达。1.7正常培养的HMCs分为:(1)正常对照组,(2)PA 24h组,(3)PA 24h+SSO组。Western blotting法检测TGF-β1、p-Smad2/3、FN、Col4A1及NFAT2蛋白表达。BODIPY?FL C16探针检测HMCs对FFAs的吸收。1.8正常培养的HMCs分为:(1)正常对照组,(2)PA 24h组,(3)SSO组,(4)PA24h+SSO组。油红染色检测HMCs脂质沉积情况。1.9正常培养的HMCs分为:(1)正常对照组,(2)PA 24h组,(3)PA 24h+CD36si RNA组。Western blotting检测TGF-β1、p-Smad2/3、FN、Col4A1及NFAT2蛋白表达。油红染色及BODIPY?FL C16探针分别检测HMCs脂质沉积和FFAs的吸收。2.HFD饲养SD大鼠6周后,一次性腹腔注射(Intraperitoneal injection,ip)低剂量STZ(35 mg/kg)诱导DN大鼠模型。造模成功后,继续给予HFD饮食8周。另设正常对照组,给予常规饮食,每组8只。实验过程中观察各组大鼠一般状况(精神状态,饮食饮水及小便情况),定期测定各组大鼠体重(Body weight),血糖(Blood glucose,BG)水平。8周后,代谢笼收集24小时尿液,测定24 h尿蛋白(Urinary protein,Upro),尿微量白蛋白(Microalbuminuria,ALB)及尿肌酐(Urine creatinnie,UCr)的含量;腹主动脉取血,测定血肌酐(Serum creatinine,SCr),尿素氮(Blood urea nitrogen,BUN),甘油三酯(Triglyeride,TG),总胆固醇(Total cholesterol,TC)及FFAs的含量。HE染色观察肾脏形态学变化;PASM,Masson染色以及电镜观察肾脏纤维化情况;免疫组织化学(Immunohistochemistry,IHC)法检测各组大鼠肾脏CD36及NFAT2的表达。Western blotting法分别检测各组大鼠肾组织中TGF-β1、p-Smad2/3、FN、Col4A1、CD36以及核蛋白NFAT2表达水平。结果:1.PA刺激HMCs后,总蛋白TGF-β1、p-Smad2/3、Col4A1、FN、CD36及核蛋白NFAT2水平显著升高,并呈时间依赖性。2.PA刺激HMCs后,细胞内脂质沉积增加,并随时间累积逐渐增多。细胞内Ca2+在PA刺激2h后开始增加,6h后细胞内Ca2+水平上升显著。3.TRPC6通道抑制剂SKF96365及si RNA可显著抑制PA诱导的TGF-β1、p-Smad2/3,Col4A1,FN以及核蛋白NFAT2的表达。4.TRPC6激活剂FA上调HMCs TGF-β1、p-Smad2/3、Col4A1、FN以及核蛋白NFAT2的表达,并增加PA诱导纤维化的作用。5.SKF96365抑制PA诱导的细胞内Ca2+增多;FA则增强PA诱导的胞内Ca2+水平上调。6.TRPC6蛋白表达在PA刺激模型中表现出反馈性调节特点:PA刺激后TRPC6表达随时间延长逐渐降低,而SKF96365则可以抑制TRPC6的下调,相反FA刺激同样可以下调TRPC6的表达。7.NFAT2 si RNA抑制PA诱导的TGF-β1、p-Smad2/3、Col4A1及FN表达增加。8.CD36抑制剂SSO可以减少FFAs的吸收并抑制PA诱导的TGF-β1、p-Smad2/3、Col4A1、FN及核蛋白NFAT2表达增加。9.SSO可诱导HMCs胞内脂质沉积并上调Ca2+水平。10.CD36 si RNA抑制HMCs对FFAs的吸收,减少胞内脂质沉积并降低Ca2+水平,抑制PA诱导的TGF-β1、p-Smad2/3、Col4A1、FN、CD36及核蛋白NFAT2表达增加。11.STZ造模后,DN组大鼠一般状况较差,精神萎靡倦怠,毛竖无光泽,动作迟缓,体重锐减,水食摄取量及尿量明显增加。BG、TG、TC、FFAs及肾功能相关指标:24h Upro、ALB、SCr、BUN较正常组显著升高,肌酐清除率(Creatinine clearance,CCr)降低。DN组肾脏指数升高,肾脏HE染色提示系膜细胞增生显著,PASM、Masson染色以及电镜结果提示DN大鼠肾小球基底膜增厚,系膜基质增多。Western blotting及IHC结果提示DN大鼠TGF-β1、p-Smad2/3、FN、Col4A1、CD36以及NFAT2蛋白表达水平均显著升高。结论:1.PA可通过激活TGF-β1/Smad诱导HMCs纤维化。2.抑制TRPC6/NFAT2信号通路对PA诱导的HMCs纤维化具有保护作用。3.PA可通过诱导CD36表达,促进HMCs对FFAs的吸收,增加胞内脂质沉积。4.抑制CD36对PA诱导的HMCs纤维化具有保护作用,其机制可能与抑制TRPC6/NFAT2通路的激活有关。第二部分基于CD36探讨黄芪甲苷对2型糖尿病肾病肾小球纤维化及氧化应激的保护作用目的:在PA刺激HMCs模型以及2型DN大鼠模型中探讨AS-IV对纤维化、氧化应激及CD36的影响。方法:1.正常培养的HMCs分为:(1)正常对照组,(2)PA 24h组,(3)PA 24h+AS-IV不同剂量组(20,40,80μΜ)。Western blotting法分别检测各组TGF-β1、p-Smad2/3、FN、Col4A1、NADPH氧化酶4(NADPH oxidase 4,NOX4)、p22phox及CD36蛋白表达水平。油红染色检测HMCs脂质沉积。DCFH-DA及DHE探针法检测细胞内ROS的水平。2.正常培养的HMCs分为:(1)正常对照组,(2)PA 24h组,(3)PA 24h+SSO组,(4)PA 24h+AS-IV组(80μΜ),(5)PA 24h+SSO+AS-IV组(80μΜ)。Western blotting法分别检测各组TGF-β1、p-Smad2/3、FN、Col4A1、NOX4及p22phox蛋白表达水平。BODIPY?FL C16探针检测HMCs对FFAs的吸收。DCFH-DA及DHE探针法检测细胞内ROS的水平。3.复制2型DN模型,方法同第一部分。STZ造模成功后,随机分为DN模型组(DN组),AS-IV(20,40,80 mg/kg)治疗组及正常对照组,每组8只,连续治疗给药8周。一般情况观察、生化指标及肾脏病理检测同第一部分。Western blotting及IHC法检测各组大鼠肾组织中TGF-β1、p-Smad2/3、FN、Col4A1、NOX4、p22phox及CD36蛋白表达水平。结果:1.AS-IV抑制PA诱导的HMCs胞内脂质沉积和FFAs吸收,下调TGF-β1、p-Smad2/3、FN、Col4A1、NOX4、p22 phox及CD36蛋白的表达,并减少ROS的生成。SSO对PA诱导的氧化应激同样具有抑制作用,但联用AS-IV其保护作用并未显著增加。2.AS-IV治疗组血糖,TG,TC,FFAs及肾功能相关指标:24h Upro,ALB,SCr,BUN较DN组显著降低,CCr升高。肾脏HE、PASM及Masson染色均提示AS-IV治疗后肾系膜增生及基底膜增厚较DN组显著好转。Western blotting及IHC结果显示AS-IV组TGF-β1、p-Smad2/3、FN、Col4A1、NOX4、p22phox及CD36蛋白表达较模型组明显降低。结论:1.AS-IV对2型DN大鼠肾脏纤维化和氧化应激具有保护作用。2.AS-IV对PA诱导的HMCs胞内脂质沉积、FFAs吸收、纤维化及氧化应激具有保护作用,其机制与AS-IV下调CD36表达有关。
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R285.5
【图文】：
HMCs 不同时间后对 TGF-β1、p-Smad2/3、Col4A1 及 FN 表达的影响expression of TGF-β1, p-Smad2/3, Col4A1 and FN in HMCs after PA stie points. (A) TGF-β1, p-Smad2/3, Col4A1 and FN expression levels were dettting. (B-E) Densitometric analysis of TGF-β1, p-Smad2/3, Col4A1 and FN expressed as the mean ±SD, n=3.*p < 0.05,**p < 0.01 as compared with BSA.加 HMCs 细胞内 Ca2+水平及核内 NFAT2 的表达 Ca2+荧光探针 Fluo-8AM 检测细胞内 Ca2+水平，荧光显微镜下观察激 HMCs 0.5h 后，细胞内 Ca2+水平未见显著改变，2h 后细胞内h 后 PA 组 Ca2+水平较 BSA 组显著增高(Fig.2, p<0.01)。为了再次确 胞内 Ca2+的诱导作用，采用流式细胞术检测 PA 刺激 6h 后的 Ca2方法结果一致(Fig.3, p<0.01)，提示 PA 可诱导 HMCs 胞内 Ca2+升
安徽医科大学博士学位论文显著升高(Fig.4 A)。Western blotting 及免疫荧光(Immunofluorescence, IF)进一测 NFAT2 随时间点变化的情况。Western blotting 结果显示核内 NFAT2 水平在激 2h 后升高，并随着 PA 刺激时间延长表达逐渐增加(Fig.4 B and C, p<0.05 1)。IF 结果同样提示 NFAT2 表达随 PA 刺激时间的延长而逐渐增加(Fig.5 or p<0.01)，且在 PA 刺激 6h 后即可观察到 NFAT2 移位入核的趋势。
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本文编号：
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