葫芦素D抑制胃癌细胞存活的作用及其机制研究

发布时间：2020-06-16 15:56

【摘要】：研究背景及目的胃癌(Gastric cancer,GC)作为世界第四大最常见的癌症,是目前全球范围内亟待解决的重大公共健康问题,据流行病学统计结果显示,全球平均每年约有99万人被诊断为胃癌,73.8万人死于胃癌,因此它也是癌症性死亡的第二大凶手。胃癌的发病率会根据年龄,性别和地域等不同而有所差异,好发年龄在50岁以上,男性胃癌的发病率是女性的2至3倍,全球范围来看,包括中国在内的亚洲东部、欧洲东部以及南美等地区发病率最高,而北美以及非洲大部分地区发病率最低。而随着现代人生活节奏的加快,饮食结构的改变,学习及工作压力的增加,胃癌发病人群呈现年轻化趋势。具体到我国,流行病学调查分析显示,我国胃癌发病例数和死亡例数分别占全球胃癌发病和死亡的42.6%和45.0%,在全球183个国家中位于发病率第5位、死亡率第6位。2012年中国胃癌新发病例约为42.4万例,其中男性新发病例约为29.8万例,女性为12.6万例。全国总人口及男性胃癌发病率均仅次于肺癌,位居同期恶性肿瘤发病率的第2位,女性胃癌发病率低于乳腺癌、肺癌和结直肠癌,位居第4位。2012年中国胃癌死亡病例约为29.8万例,其中男性死亡病例约为20.6万例,女性约为9.2万例。全国胃癌死亡率为22.04/10万。全国总人口及男性胃癌死亡率仅低于肺癌和肝癌,位居同期恶性肿瘤死亡率第3位,女性胃癌死亡率仅低于肺癌,位居第2位。我国是胃癌高发国家,胃癌仍是严重危害中国居民健康的主要疾病之一,降低我国胃癌的发病率和死亡率越来越成为我们必须直面的重大公共卫生问题。目前,大多数胃癌患者被诊断为晚期胃癌,65%~75%有根治愿望的患者在接受治疗后面临的是复发及系统性疾病的结局。近年来,随着科学技术的发展,胃癌诊疗技术不断提高,尤其是手术、内镜技术、放化疗、靶向治疗等综合治疗方式的进步,胃癌的治疗效果有所提升,但对于晚期及伴转移病灶的胃癌患者,综合治疗的预后仍不理想。对于被诊断为不适宜手术的原位癌或转移癌的患者,化疗是重要的临床治疗手段,常用药物有奥沙利铂、5-氟尿嘧啶(5-FU)、多西他赛、伊立替康等,但由于上述药物在长期应用的情况下耐药率较高且药物细胞毒性作用很大,化疗也只能为患者带去12个月的中位生存率。因此,寻找低毒、高效的新型化学药物用于治疗胃癌具有重要意义。葫芦素(Cucurbitacin)是一组从葫芦科和十字花科植物中提取的天然三萜系化合物。现代研究报道葫芦素在多种肿瘤疾病中均发挥抗炎、抗肿瘤的作用,可抑制多种肿瘤细胞系的细胞生长并促进其凋亡。其中葫芦素B、D、E、I、F、O、P和Q均可通过抑制STAT3磷酸化而抑制肿瘤细胞的增殖与分化。据报道,从瓜蒌中提取的葫芦素D可诱导多种肿瘤细胞凋亡,可以影响Stat3及NF-κB等多种信号转导途径。化疗诱导肿瘤细胞凋亡是临床上肿瘤疾病治疗的重要手段,葫芦素D作为潜在的抗肿瘤药物具有一定的研究价值。但目前关于葫芦素D在胃癌细胞中的作用及其诱导细胞凋亡的具体分子机制尚不明确,有待进一步研究。在细胞水平,本课题研究了多浓度梯度、时间梯度下,葫芦素D对胃癌AGS、SNU1、HS76T细胞增殖和凋亡的影响;应用SC79激活Akt的表达,左旋刀豆氨酸(L-canavanine)抑制iNOS的表达,并探讨葫芦素D发挥抗胃癌作用的潜在机制;在组织水平,本课题构建了裸鼠移植瘤模型,在体研究葫芦素D对胃癌增殖和凋亡的影响,旨在探讨葫芦素D对胃癌的在体作用及其分子机制。方法1.应用CCK-8法检测不同浓度梯度及时间梯度下,Cucurbitacin D对胃癌AGS、SUN1、Hs746T细胞体外增殖的影响;选用DCFH-DA荧光探针检测不同浓度Cucurbitacin D对胃癌AGS、SUN1、Hs746T细胞内ROS水平的影响;应用TUNEL染色法探讨Cucurbitacin D对胃癌AGS、SUN1、Hs746T细胞凋亡的影响;还检测了不同浓度梯度及时间梯度下,Cucurbitacin D对胃癌AGS、SUN1、Hs746T细胞内Ca~(2+)及NO含量的影响。2.通过Western blot法检测了Cucurbitacin D对胃癌AGS细胞的iNOS、Bax等凋亡信号通路和Akt信号通路相关信号分子的蛋白表达的影响;分别选用iNOS抑制剂L-canavanine干扰胃癌AGS细胞内iNOS的表达,选用Akt激动剂SC79干扰胃癌AGS细胞内Akt的活化,应用CCK-8法检测L-canavanine及SC79对Cucurbitacin D介导的抑制胃癌AGS细胞体外增殖作用的影响;应用TUNEL法检测L-canavanine及SC79对Cucurbitacin D诱导胃癌AGS细胞体外凋亡作用的影响;给小鼠按1×10~6个细胞/只的量注射胃癌AGS细胞以构建胃癌裸鼠皮下移植瘤模型,给药途径选用腹腔注射,观察并记录裸鼠皮下移植瘤的生长情况,记录瘤体长径和短径以计算体积,当瘤体体积达到200mm~3后,给予Cucurbitacin D及SC79腹腔注射;实验结束后,取材,绘制裸鼠皮下移植瘤的生长曲线,检测Cucurbitacin D及SC79对皮下移植瘤瘤体生长的影响;选用TUNEL法检测Cucurbitacin D及SC79对皮下移植瘤瘤体组织细胞凋亡情况的影响,以分析探讨Cucurbitacin D抗胃癌作用的体内外潜在分子机制。结果1.CCK-8检测结果显示,Cucurbitacin D对胃癌AGS、SUN1、Hs746T细胞体外增殖均有抑制作用,与对照组相比,Cucurbitacin D处理组的细胞数量明显减少,且该作用呈明显的浓度及时间依赖性,即随着药物浓度的增加及药物作用时间的延长,其抑制作用逐渐增强(P0.05);ROS检测结果显示,与对照组相比,胃癌AGS、SUN1、Hs746T细胞在经Cucurbitacin D药物处理后,其细胞内ROS含量均明显增加(P0.05),且该作用呈现浓度依赖性,即随着药物浓度的增加ROS含量逐渐增多;TUNEL染色结果显示,与对照组相比,随Cucurbitacin D浓度增加,胃癌AGS、SUN1、Hs746T细胞凋亡率均逐渐升高(P0.05);而与对照组相比,随Cucurbitacin D浓度增加及作用时间的延长,胃癌AGS、SUN1、Hs746T细胞内Ca~(2+)浓度及NO含量均逐渐增加,且该作用呈明显的浓度及时间依赖性(P0.05)。2.Western blot结果显示,与对照组相比,随着Cucurbitacin D浓度增加,胃癌AGS细胞中iNOS、Bax、Cleaved caspase-9及cytochrome蛋白表达量明显增多,同时Bcl-2蛋白表达量明显减低(P0.05);此外,Western blot结果显示,与对照组相比,随Cucurbitacin D浓度增加,胃癌AGS细胞Akt、mTOR及rs6的蛋白磷酸化水平明显降低(P0.05)。为进一步探讨Cucurbitacin D抑制胃癌细胞增殖及促凋亡作用的潜在机制,本实验分别应用L-canavanine及SC79干预胃癌AGS细胞iNOS的表达及Akt的活化,设置对照组、Cucurbitacin D组、SC79组、Cucurbitacin D+SC79组、L-canavanine组、Cucurbitacin D+L-canavanine共六组;体外增殖与凋亡相关实验CCK-8法、TUNEL染色结果共同表明,与正常对照组及Cucurbitacin D组相比,Akt激活剂SC79可显著消除Cucurbitacin D对胃癌AGS细胞的体外增殖抑制和凋亡诱导作用;同样地,与正常对照组及Cucurbitacin D组相比,iNOS抑制剂L-canavanine也可拮抗Cucurbitacin D对胃癌AGS细胞的体外增殖抑制和凋亡诱导作用;构建胃癌裸鼠皮下移植瘤模型,随机分为对照组、Cucurbitacin D组、SC79组、Cucurbitacin D+SC79四组,观察并记录裸鼠皮下移植瘤生长的长径(L)及短径(W),按公式V(mm~3)=LW~2×0.5236计算瘤体体积并绘制裸鼠皮下移植瘤生长曲线,结果显示,与对照组相比,Cucurbitacin D可明显抑制瘤体的生长,而SC79可拮抗该抑制作用(P0.05)。瘤体组织包埋、切片后进行TUNEL染色,实验结果显示,与阴性对照组相比,Cucurbitacin D处理组移植瘤胃癌的棕黄色凋亡细胞更多,凋亡细胞比例更高(P0.05),而SC79处理后阻断了Cucurbitacin D对瘤体胃癌细胞的促凋亡作用(P0.05)。结论Cucurbitacin D在体内外均具有一定的抗胃癌作用;Cucurbitacin D可干扰iNOS表达及Akt的活化、促进细胞内ROS、Ca~(2+)的蓄积,增加细胞内ATP及NO的含量,通过影响iNOS/NO信号通路及Akt信号通路发挥抗胃癌作用。
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R285
【图文】：

分子结构图,分子结构,葫芦素,胃癌

引言amycin, mTOR）等相关信号分子的表达水平，并用抑制剂干扰 iNOS 和表达与活化后检测它们对葫芦素 D 抗胃癌作用的影响；在体实验选择裸移植瘤模型用于检测葫芦素 D 对胃癌体内增殖和凋亡作用的影响。上述在明确葫芦素 D 在体内外具有抗胃癌作用，并探讨了其可能的机制。

梯度,胃癌细胞株,细胞株,胃癌

图 2.1 CCK-8 法检测 Cucurbitacin D 对胃癌 AGS、SUN1、Hs746T 细胞增殖的抑制作用选用 5 个不同浓度梯度的 Cucurbitacin D（0.25、0.5、1、1.5、2μm）及 4 个不同刺激时间梯度（12、24、48、72h）对不同胃癌细胞株 AGS 细胞株（图 2.1A）、SUN1 细胞株（图2.1B）和 Hs746T 细胞株（图 2.1C）细胞增殖的影响。*表示与对照组（0μm）比较，P＜0.05。2.2 Cucurbitacin D 对胃癌细胞内 ROS 水平的影响应用 DCFH-DA 检测细胞内 ROS 含量，其原理如下：DCFH-DA 为氧化敏感型荧光探针（无自发荧光），可穿过细胞膜而进入胞内，在细胞内酯酶的水解作用下生成为 DCFH，生成的 DCFH 同样自身无荧光但无法穿过胞膜，因此DCFH 聚集在胞内，在胞内 ROS 的作用下发生氧化作用，生成 DCF，DCF 则是有荧光的。所以，细胞内 ROS 水平的含量，可以通过检测到的 DCF 荧光的强弱得到直观的反应，荧光显微镜或荧光酶标仪均可用于检测。有研究表明，增加细胞内 ROS 的产生是 Cucurbitacin 家族发挥抗肿瘤作用的机制之一。本部分研究中即通过 DCFH-DA 检测不同浓度 Cucurbitacin D 对胃癌 AGS、SUN1、Hs746T 细胞内 ROS 水平的影响。六孔板内放入细胞爬片培养

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