青藤碱对乳腺癌细胞诱导的骨破坏的影响和分子免疫机制研究

发布时间：2020-06-17 07:02

【摘要】：背景及目的:骨骼是进展期恶性肿瘤常见的转移部位,其中80%是由乳腺癌、前列腺癌和肺癌引起的。肿瘤转移至骨通过释放一系列因子激活破骨细胞,吸收骨基质,造成溶骨性病变,继而引起病理性骨折、高钙血症、难以忍受的骨痛和神经压迫症状等一系列的骨骼相关事件。破骨细胞起源于骨髓单核-巨噬细胞谱系细胞,是体内唯一负责吸收骨质的细胞,正常情况下与成骨细胞介导的骨形成,维持动态平衡。在一些刺激因素存在下,破骨细胞过度激活,将引起一系列骨破坏相关疾病。在一些肿瘤细胞引起的骨破坏中发现破骨细胞处于过度激活状态。因此,靶向破骨细胞的药物可以有效缓解肿瘤细胞引起的骨破坏,并且提高患者的生活质量和改善预后。目前临床上用于预防和治疗骨转移事件的代表性药物有双膦酸盐类的唑来膦酸和生物制剂denosumab单抗,这些药物都是针对破骨细胞的。但是,近来研究发现长期服用双磷酸盐类药物会抑制骨组织的自然更新,能够引起非脊柱骨折患者骨折愈合延迟,同时也会增加股骨干骨折的风险。Denosumab为完全的人单克隆抗体,由安进(Amgen)公司生产,2010年11月获美国FDA批准用于实体瘤骨转移患者预防骨骼相关事件的发生;通过抑制核因子-κB受体活化因子配体(RANKL)的活性,而抑制破骨细胞生成引起的骨破坏和骨吸收。但其需要皮下注射,价格亦昂贵,而且存在下颌骨坏死等严重并发症。因此急需继续研究服用方便,安全有效的预防和治疗肿瘤骨转移相关事件药物。青藤碱是从中药青风藤中提取的单体药物,具有显著的镇痛镇静、抗炎作用,临床上广泛用于治疗风湿性及类风湿性关节炎。近年来,随着对青藤碱研究的深入,其在抗肿瘤方面的作用也愈来愈受到国内外学者重视,有研究发现青藤碱对乳腺癌、前列腺癌、肺癌及肝癌等多种肿瘤都有较好的抑制作用。与目前临床用药唑来膦酸和denosumab相比,青藤碱在镇痛方面的优势突出。此外,唑来膦酸常伴有流感样症状(发热、关节痛、肌痛、一过性骨痛)的不良反应,有研究发现用选择性环氧化酶-2(COX-2)抑制剂塞来昔布等可以缓解以上不良症状,而青藤碱作为选择性COX-2抑制剂的一种,亦可以用于预防给药缓解唑来膦酸引起的不良反应。此外,我们小组前期研究发现青藤碱能够抑制RANKL和LPS诱导破骨细胞的生成和骨破坏,但其对肿瘤引起的破骨细胞生成和骨破坏的影响未见报导。因此,本课题拟研究青藤碱对人乳腺癌细胞MDA-MB-231诱导的骨破坏的影响及分子免疫机制。实验方法:1.在体内,建立人乳腺癌细胞MDA-MB-231诱导的骨破坏模型。将人乳腺癌细胞MDA-MB-231注射入裸鼠胫骨骨髓腔内构建裸鼠骨破坏模型,造模4周后,处死裸鼠并取其胫骨。通过Micro-CT分析检测青藤碱对造模裸鼠胫骨骨小梁参数BMD、BV/TV、Tb.N以及Tb.Sp等的影响,以及HE染色评价青藤碱对人乳腺癌细胞MDA-MB-231诱导的裸鼠骨破坏中骨小梁结构的影响。2.在体外,建立人乳腺癌细胞MDA-MB-231及培养上清(conditioned medium,CM)诱导的小鼠单核巨噬细胞RAW264.7分化形成破骨细胞的体系。通过MTT实验检测青藤碱对RAW264.7细胞的增殖毒性作用;通过TRAP染色检测青藤碱对MDA-MB-231细胞及CM诱导的RAW264.7向破骨细胞分化的影响;通过骨吸收陷窝实验检测青藤碱对CM诱导的破骨细胞骨吸收能力的影响;通过qRT-PCR检测青藤碱对CM诱导的破骨细胞形成相关基因表达的影响。3.收集乳腺癌细胞MDA-MB-231的培养上清作为条件性培养基(conditioned medium,CM)检测青藤碱抑制CM诱导的RAW264.7细胞分化形成破骨细胞的作用机制。利用荧光素酶报告基因系统检测青藤碱对NF-κB转录因子的转录活性的影响:利用Western blot检测青藤碱对破骨细胞形成最重要的下游信号通路NF-κB、MAPKs(p38、JNK and ERK 1/2)、c-Fos、NFATc1 相关蛋白的影响以及qRT-PCR检测c-fos和NFATc1的基因表达。4.探究青藤碱对乳腺癌细胞MDA-MB-231分泌的可以诱导破骨细胞形成的相关因子的影响。利用qRT-PCR检测青藤碱对乳腺癌细胞MDA-MB-231分泌的 TNF-α、IL-1、TGF-β、PTH-rP、M-CSF、IL-6、IL-8 等因子基因表达水平的影响。接着,利用ELISA进一步检测青藤碱对乳腺癌细胞MDA-MB-231分泌IL-8蛋白水平的影响。最后,为了确定IL-8在青藤碱抑制乳腺癌细胞MDA-MB-231诱导的破骨细胞形成中的重要作用,我们利用qRT-PCR检测了青藤碱对RAW264.7细胞表面的IL-8受体CXCR1表达的影响。实验结果:1.在体内,青藤碱能够抑制乳腺癌细胞MDA-MB-231诱导的裸鼠溶骨性骨破坏。通过Micro-CT检测结果以及HE染色结果显示,与模型组相比,150 mg/kg青藤碱可以有效抑制乳腺癌细胞MDA-MB-231诱导的裸鼠骨侵蚀水平。2.在体外,青藤碱可以抑制乳腺癌细胞MDA-MB-231及其培养上清诱导的破骨前体细胞分化形成破骨细胞。MTT增殖实验结果表明,青藤碱用量小于1 mM时对RAW264.7细胞的增殖无明显影响。TRAP染色实验结果表明,同诱导对照组相比,青藤碱可以显著抑制乳腺癌细胞MDA-MB-231及培养上清诱导的破骨细胞形成;骨吸收陷窝实验结果表明,与诱导对照组相比,0.5 mM青藤碱可以显著抑制破骨细胞骨吸收陷窝的产生;qRT-PCR实验结果显示,同诱导对照组比较,青藤碱可以显著抑制TRAP、OSCAR等破骨细胞标志性基因的表达。3.青藤碱可以通过抑制乳腺癌细胞MDA-MB-231培养上清诱导的破骨细胞形成信号通路下游转录因子c-Fos、NFATc1表达来抑制破骨细胞形成,但不影响NF-κB和MAPKs信号通路的活化。NF-κB荧光素酶报告基因结果表明,0.25-1 mM青藤碱不能够抑制CM诱导的NF-κB荧光素酶报告基因表达上升。Western blot实验结果表明,与诱导对照组相比,0.25-1 mM青藤碱不影响NF-κB p65和MAPKs(JNK、ERK、p38)磷酸化水平。qRT-PCR及Western blot实验结果显示,同诱导对照组相比,青藤碱可以显著抑制c-Fos、NFATc1破骨细胞分化相关转录因子的表达。4.青藤碱除影响破骨细胞形成的下游信号外,青藤碱还能够显著抑制乳腺癌细胞MDA-MB-231分泌IL-8,以及破骨前体细胞RAW264.7表面IL-8受体CXCR1的表达。qRT-PCR结果发现青藤碱可以显著抑制乳腺癌细胞MDA-MB-231中IL-8基因表达水平。接着,通过ELISA检测发现青藤碱不仅可以抑制乳腺癌细胞MDA-MB-231分泌IL-8蛋白,而且青藤碱还可以抑制乳腺癌细胞MDA-MB-231和破骨前体细胞RAW264.7共培系统中乳腺癌细胞分泌IL-8。qRT-PCR实验结果表明,青藤碱可以明显抑制CM诱导的破骨前体细胞RAW264.7表面IL-8受体CXCR1的表达。实验结论:1.在体内,青藤碱可以抑制乳腺癌细胞MDA-MB-231诱导的骨破坏。2.在体外,青藤碱可以抑制乳腺癌细胞MDA-MB-231及其培养上清诱导的破骨前体细胞分化形成破骨细胞。3.青藤碱可以通过IL-8-CXCR1、c-Fos-NFATc1信号通路抑制乳腺癌细胞MDA-MB-231诱导的破骨细胞形成,从而减轻乳腺癌细胞诱导的裸鼠溶骨性骨破坏。
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R285
【图文】：

破骨细胞形成,过程,途径

三、肿瘤诱导的骨破坏的形成逡逑那么，肿瘤诱导的骨破坏是怎样形成的呢？目前研究较认可的有以下２种：逡逑ＲＡＮＫＬ依赖途径和ＲＡＮＫＬ非依赖途径，见下图２逡逑ＴＵｍｏｒ邋ｃｅｌｌｓ邋＠逦逦逡逑ＰＴＨ－ｆＰ逦ＩＬ－８邋ＩＬ－６邋ＩＬ－１１邋ＲＡＮＫＬ逡逑／逦ＴＮＦ－ａ邋ＩＬ－１逦＼逦、Ｓ＾逡逑／逦／邋Ｍ邋ＣＳＦ邋＼逦￣、逦＼邋ＴＧＦ－Ｐ逡逑ＪＬ邋ｕ／逦＾逦Ｐｒｅ－0Ｃ邋＼邋ｉＧＦｓ逡逑Ｐｒｅ－ＯＢ邋｛逦Ａ邋ＢＭＰ逡逑Ｂｏｎｅ＾ｔｒｔｘ逡逑Ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔ逡逑＃逡逑图２肿瘤骨转移诱导破骨细胞形成过程（参照文献［５＇１２＇１３］作图）。逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２邋Ｏｓｔｅｏｌｙｔｉｃ邋ｂｏｎｅ邋ｄｅｓｔｒｕｃｔｉｏｎ邋ｉｎｄｕｃｅｄ邋ｂｙ邋ｔｕｍｏｒ邋ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ．逡逑２逡逑

破骨细胞形成,信号通路,破骨细胞,骨吸收

前言而促进破骨细胞的形成与分化。ＮＦＡＴｃｌ的活化主要分两个过程：早期和自放大阶段。早期激活阶段由ＮＦ－ｋＢ信号通路调控，ＡＰ－１和Ｃａ２＋参与其自放大阶段［１８］。ＮＦＡＴｃｌ是调控破骨细胞分化的终末开关，直骨细胞分化和骨吸收相关的基因表达如抗酒石酸碱性磷酸酶（ＴＲＡＰ）、胞相关受体（Ｏｓｃａｒ）、金属基质蛋白酶９（ＭＭＰ－９）、整合素Ｐ３（ｌｎｔｅｇｒｉｎ织蛋白酶Ｋ邋（ｃａｔｈｅｐｓｉｎＫ）等，促进破骨细胞分化成熟，增加骨吸收活ＲＡＮＫＬ逦＿逦ｏｓｔｅｏｃａｓｔｐｒｏｇｅｎｍｏ．逡逑

【参考文献】