丹皮酚通过升高单核细胞来源的外泌体miR-223抑制STAT3介导的内皮细胞炎症反应

发布时间：2020-06-18 19:42

【摘要】：动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)是多种细胞参与的动脉血管的慢性炎症性疾病。血管内皮细胞(vascular endothelial cells,VECs)的炎症损伤是AS形成的始动环节和关键因素,会继发炎症因子、粘附分子的异常分泌、免疫细胞粘附、浸润等事件。细菌脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)是AS感染的主要诱因,可激活先天免疫,进而导致VECs损伤。外泌体作为细胞释放的细胞外囊泡(extracellular vesicles,EVs)的一个亚群,可促进多肽、microRNAs(miRNAs,miRs)在细胞和组织之间交换。单核/巨噬细胞(Monocyte/macrophage,M/MΦ)来源的外泌体(M/MΦ-exo)包含丰富的具有抗炎作用的miR-223,miR-223可能通过调控其下游STAT3(signal transducers and activators of transcription 3,STAT3)等炎症靶基因延缓AS的发生发展。因此,miR-223作为STAT3上游的调控因子,将可能是治疗AS的一个新型治疗靶点。丹皮酚(paeonol,Pae)是从是中药植物牡丹的干燥根皮中提取纯化得到的主要活性成分之一,具有抗炎、降血脂、活血化瘀等广泛药理作用。我们前期的研究已证实Pae对损伤的VECs具有一定保护作用,然而该保护作用是否与Pae通过调控M/MΦ释放的外泌体miR-223水平有关尚需进一步探究。首先在体内实验中,我们在高脂喂养ApoE~(-/-)小鼠中观察Pae的治疗作用以及对小鼠主动脉中VECs中STAT3通路和miR-223表达的影响。在体外实验中,以LPS作为炎症诱导因子,激活THP-1细胞,观察LPS刺激的THP-1细胞外泌体在共培养条件下以及单独提取外泌体后对共孵育的HUVEC的影响。从基因水平阐明Pae调控的单核细胞外泌体对VECs炎症反应的作用,为Pae应用于治疗AS提供新靶点和科学依据。目的探讨Pae对STAT3通路介导AS小鼠炎症以及和miR-223的表达情况,Pae对LPS刺激的单核细胞外泌体miR-223的表达差异及其在VECs中对靶蛋白STAT3的负调控作用,为揭示单核外泌体为潜在靶点的抗AS药物防治提供新的思路。方法高脂饮食喂养ApoE~(-/-)小鼠复制AS模型;HE染色法观察小鼠主动脉病变;ELISA法检测IL-1β、IL-6的表达;Western blot法检测STAT3、pSTAT3、ICAM-1、VCAM-1的表达;免疫组织化学法检测各组主动脉CD68、p-STAT3的表达;qPCR检测miR-223的表达;建立THP-1/HUVEC共培养体系;透射电镜观察外泌体形态;DLS和NTA检测外泌体电位和粒径分布,Western blot法检测外泌体标志蛋白,采用激光共聚显微镜观察HUVEC对外泌体摄取;流式细胞仪检测摄取率;双荧光素酶基因报告实验对miR-223靶基因的验证。结果1 Pae抑制ApoE~(-/-)小鼠斑块形成以及炎症介质的表达我们建立了高胆固醇饮食喂养的ApoE~(-/-)小鼠AS模型,Pae可减轻AS病变明显,减小斑块的面积显著;降低ApoE~(-/-)小鼠血清炎症因子IL-1β、IL-6的水平;降低ApoE~(-/-)小鼠主动脉粘附分子ICAM-1、VCAM-1的水平;抑制ApoE~(-/-)小鼠主动脉M/MΦ的粘附浸润以及主动脉pSTAT3的表达;Pae可显著升高ApoE~(-/-)小鼠主动脉miR-223的含量。2 Pae抑制与LPS刺激的THP-1细胞共培养的HUVEC炎症反应Pae(24h,60μM)可以LPS抑制刺激的THP-1细胞的活力;升高LPS刺激的THP-1中miR-223的表达。之后我们建立THP-1与HUVEC的共培养体系,我们发现THP-1中miR-223的含量远远高于HUVEC,且在共培养体系中可将miR-223传递给HUVEC;Pae升高与LPS刺激的THP-1细胞共培养的HUVEC中miR-223的表达;而Pae,外泌体分泌抑制剂GW4869,外泌体摄取抑制剂Heparin均会降低LPS刺激细胞共培养体系HUVEC中IL-1β、IL-6、VCAM-1、ICAM-1的水平的升高。3 Pae对外泌体的生物学形态影响为验证外泌体的功能,我们用超滤离心法提取不同情况下的外泌体,用多种方法对外泌体进行表征,透射电镜观察到各组外泌体具有明显的具有茶托样膜结构;Western blot检测外泌体标志蛋白CD63、CD9、LAMP2、CD54、Alix、TSG101、HSP70的表达量明显高于各THP-1细胞组,而阴性对照Calnexin则不在外泌体中表达;纳米粒子示踪分析仪(NTA)与纳米激光粒度分析仪(DLS)表明各组外泌体整体颗粒峰值在105 nm左右,电位值在-10左右,各组无显著差异。4 Pae通过外泌体缓解对HUVEC炎症反应为排除Pae预处理THP-1细胞来源的外泌体含有的Pae对下游实验的干扰,我们用HPLC法检测不同浓度Pae处理下外泌体中Pae的含量,我们发现外泌体中Pae的含量随Pae处理浓度的升高而升高;外泌体中微量的Pae(0.5,2,8 nM)对HUVEC活力没有影响,且对LPS-exo刺激的HUVEC活力没有治疗作用,Con-exo并不影响HUVE活力,LPS-exo可以呈浓度梯度显著降低HUVEC细胞活力,而各组Pae-exo对HUVEC活力的抑制并不明显;摄取外泌体后升高HUVEC中miR-223的表达;Pae-exo与LPS-exo比,可升高HUVEC中miR-223的水平;Pae-exo与LPS-exo比,可降低HUVEC中IL-1β、IL-6、ICAM-1、VCAM-1的水平及HUVEC对THP-1细胞的粘附;可降低HUVEC中STAT3,pSTAT3的水平。5 Pae通过升高THP-1源性外泌体miR-223抑制HUVEC的STAT3通路双荧光素酶基因报告实验验证miR-223靶基因为STAT3 mRNA,转染miR-223 mimic后,可以升高泌体和摄取外泌体后的HUVEC中miR-223的含量,降低STAT3和p-STAT3的表达,抑制IL-1β,IL-6,ICAM-1,VCAM-1的水平及HUVEC对THP-1细胞的粘附。而miR-223 inhibitor可以逆转Pae的作用,升高STAT3和p-STAT3的表达,提高IL-1β,IL-6,ICAM-1,VCAM-1的水平及HUVEC对THP-1细胞的粘附。结论1.Pae抗ApoE-/-小鼠AS的机制可能与抑制STAT3炎症通路极其下游IL-1β,IL-6,ICAM-1,VCAM-1的表达,单核细胞粘附有关。2.Pae可以升高单核细胞外泌体miR-223的含量,可以升高摄取外泌体后的HUVEC中miR-223的含量,降低STST3,p-STAT3的表达,抑制HUVEC中IL-1β,IL-6,ICAM-1,VCAM-1的表达,降低单核细胞粘附;而miR-223 inhibitor可以逆转Pae的作用。
【学位授予单位】：安徽中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R285
【图文】：

示意图,假说,示意图,单核细胞

皮酚通过升高单核细胞来源的外泌体 miR-223 抑制 STAT3 介导的内皮细胞炎症反应实验首先在体内实验中，我们在高脂饮食的 ApoE-/-小鼠中观察丹皮酚的以及对小鼠主动脉中 VECs 中 STAT3 通路和 miR-223 表达的影响。在体，以 LPS 作为炎症诱导因子，激活单核细胞，观察 LPS 诱导的单核细胞共培养条件下以及单独提取外泌体后与 VECs 共孵育后，VECs 中 miR-2以及 STAT3 介导的炎症通路的激活，通过转染 miR-223 mimic 或 inhibitmiR-223 过表达或低表达的外泌体对 STAT3 的调控，及 Pae 对 LPS 诱导胞外泌体中 miR-223 的影响，从基因水平阐明单核细胞外泌体在 VECs的作用及 Pae 的调控作用的科学依据，为 Pae 应用于治疗 AS 提供新靶流程见附录）。

内源性,分装,悬液,孔板

lls/mL )悬液接种于 96 孔板中（25、50、100、200、400μg/m量为药物含量对照（0.5、2、量 Pae 的对照组，每个浓度、48 h 后每孔加入 10 μL CCK A 值。按下式计算细胞的存 FBS（Exo-free FBS）的 Kda 的超滤离心管中 500mL 每管 10mL，配平后 120000g，将新获得的分装，与浓缩上 Fig 2）。

【参考文献】