基于肠道菌群探讨护肝清脂片防治非酒精性脂肪肝病的相关机制

发布时间：2020-06-23 07:22

【摘要】：研究背景及目的非酒精性脂肪肝(nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)被认为是代谢综合征在肝脏的表现,其发病率不断上升,目前已超越慢性乙型肝炎成为国内外第一大慢性肝病。近年来,随着肠肝轴理论的提出,以肠道菌群为靶点研究NAFLD的发病机制越来越受到大家的重视。护肝清脂片(Hugan Qingzhi Tablet,HQT)在临床上主要用于防治NAFLD,体内体外试验均证实1.08g/kg的HQT可有效改善NAFLD大鼠胰岛素抵抗、脂质蓄积、慢性炎症,但具体药效机制仍有待阐明。本团队前期蛋白质组学实验中发现与高脂饲料(high fat diet,HFD)组对比,HQT可上调NAFLD大鼠肝脏微生物代谢通路的表达,初步提示护肝清脂片防治NAFLD的机制有可能与肠道菌群有关。HQT主要成分包括泽泻、山楂、蒲黄、荷叶及三七,本团队前期采用UHPLC-QqQ-MS检测发现HQT中含有大量黄酮类成分如异鼠李素、槲皮素、芦丁及香蒲新苷等成分,文献报道肠道菌群可广泛代谢黄酮类成分,影响其生物活性,反过来,黄酮类成分如芦丁、槲皮素等也可调节代谢综合征导致的机体肠道菌群紊乱,考虑到HQT为口服给药,不可避免的会与机体胃肠道发生接触,我们推测,护肝清脂片很可能是通过调节肠道菌群结构、保护肠黏膜屏障等机制起到防治NAFLD的作用。研究方法1、采用高脂饲料建立NAFLD大鼠模型,将大鼠随机分为3组:普通饲料(Normal fat diet,NFD)组、高脂饲料(High fat diet,HFD)组、1.08g/kg HQT+高脂饲料组,12周结束后,测定各组大鼠的肝脂质含量、炎症指标水平,油红O染色及苏木精-伊红染色(hematoxylin-eosin staining,HE)切片观察各组大鼠肝组织病变程度。2、运用16SrRNA测序技术来研究HQT对NAFLD大鼠肠道菌群结构及功能的调节作用。3、运用GC-MS方法对实验结束后各组大鼠粪便短链脂肪酸(short-chain fatty acids,SCFAs)的含量进行测定。4、采用ELSA试剂盒测定各组大鼠血清LPS含量,运用HE染色法观察各组大鼠回肠粘膜组织病理变化,并运用免疫组化法观察各组大鼠回肠粘膜紧密连接蛋白claudin-1和ZO-1的表达和分布,同时采用qRT-PCR及Western blotting试验观察各组大鼠肝脏Toll样受体4(TLR4)信号通路的表达。研究结果1、动物实验表明HQT可降低NAFLD模型大鼠肝组织匀浆甘油三脂(triglyceride,TG),胆固醇(cholesterol,CHOL)、低密度脂蛋白(low-density lipoprotein-cholesterol,LDLC)等指标水平,同时显著升高高密度脂蛋白(high-density lipoprotein-cholesterol,HDLC)水平;此外,还可显著抑制肿瘤坏死因子α(Tumor necrosis factor,TNF-α)、白介素-6(interleukin-6,IL-6)及白介素1β(interleukin-1β,IL-1β)炎症因子水平;肝组织油红O及HE切片染色结果显示,HQT可显著改善NAFLD大鼠肝细胞脂质沉积。2、16SrRNA测序结果显示:①HQT的干预提高了NAFLD大鼠与NFD组大鼠肠道菌群OTU组成的相似性;②降低了NAFLD大鼠肠道菌群中的厚壁菌门/拟杆菌门(Firmicutes to Bacteroidetes,F/B)的比值;③促进了norank f Bacteroidales S24 7 group 和 Ruminococcaceae,Bifidobacterium、Alistipe和Anaeroplasma等有益菌的生长,同时抑制了有害菌Cronobacter,Streptococcus,Holdemanella及Blautia的滋生;④环境因子相关性分析发现Blautia和Holdenmanella与NAFLD相关疾病指 TG,CHOL,LDL-C,IL-6,IL-1β,TNF-α及大鼠体重呈显著性正相关,与HDL-C呈显著性负相关(p0.001);而norank_f__Bacteroidales_S24-7_gropup Alistipes 2个菌属则呈现相反趋势(p0.001);⑤16S功能预测分析提示,相较于HFD组,HQT组大鼠肠道菌群类黄酮生物合成代谢途径表达显著性增强(p0.05)。3、与HFD组对比,HQT组大鼠肠道内除乙酸盐之外,丙酸、异丁酸、丁酸、戊酸、异戊酸及己酸,总SCFAs含量水平均显著性升高(p0.01)。4、HQT的干预可显著降低NAFLD大鼠体内血清内毒素的含量(p0.05),回肠组织HE切片染色结果显示,HQT可抑制肠上皮细胞坏死脱落,减轻NAFLD大鼠肠黏膜固有层的水肿以及有效降低肠黏膜中的炎性细胞含量,HQT可显著上调NAFLD大鼠回肠组织粘膜claudin-1和ZO-1的表达(p0.01),护肝清脂片可显著抑制NAFLD大鼠肝脏TLR4信号通路蛋白TLR4、髓样分化因子88(MyD88)、核因子κB(NF-κB)的表达(p0.05)。结论HQT可通过调节NAFLD大鼠肠道菌群结构,抑制有害菌,促进有益菌的生长,促进丙酸、丁酸等SCFAs的含量生产,减少LPS的产生,促进肠紧密连接蛋白claudin-1和ZO-1的表达,降低肠黏膜机械屏障的通透性,并下调肝脏TLR4信号通路,从而减少有害菌及其代谢产物经肠道血流经门静脉进入肝脏,起到改善肝脏脂质沉积及炎症的效果。
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R285.5
【图文】：

油红,肝脏脂质,护肝,高脂饮食

油红０染色定量提示经过１２周高脂饮食的喂养，ＨＦＤ组大鼠肝脏油红０逡逑染色切片提示脂质沉积将近４１．８７％，而护肝清脂片可以显著降低ＮＡＦＬＤ大鼠逡逑肝脏脂质沉积（

油红,大鼠,统计学意义,肝脏脂质

｜邋０－＊逦■逦．逦逡逑＾邋＾邋＊逡逑图１－６各组大鼠肝脏ＨＥ染色ＮＡＳ评分结果逡逑Ｆｉｇ．邋１－６．邋Ｔｈｅ邋ｒｅｓｕｌｔｓ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋ＮＡＳ邋ｏｆ邋ｅａｃｈ邋ｒａｔｓ邋ｇｒｏｕｐ５邋ｌｉｖｅｒ邋ＨＥ邋ｓｔａｉｎｉｎｇ逡逑注：以上数据以ｍｅａｎ士ＳＤ的形式表示，其中＞＜０．０５，邋＞＜０．０１，表示和ＨＦＤ组比较逡逑有统计学意义；＃ｐ＜0．0５，邋＃＃ｐ＜０．０１，表示和ＮＦＤ组比较有统计学意义。（每组８只大鼠）逡逑３．５．２．４油红Ｏ染色评分结果逡逑油红０染色定量提示经过１２周高脂饮食的喂养，ＨＦＤ组大鼠肝脏油红０逡逑染色切片提示脂质沉积将近４１．８７％，而护肝清脂片可以显著降低ＮＡＦＬＤ大鼠逡逑肝脏脂质沉积（图１－７）。逡逑１６逡逑

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