桑叶多酚的物质组成分析及其对二糖消化的影响

发布时间：2020-06-26 06:45

【摘要】：多酚是一种重要的植物次生代谢物,在水果、蔬菜等植物性食物中大量存在,植物多酚对糖代谢的积极干预作用已经受到国内外的广泛关注。我国蚕桑产业体量居世界首位,丰富的桑叶资源主要用于养蚕农业生产,其重要的食用和药用价值未得到充分利用与开发。现代药理学研究已证实了桑叶多酚辅助降血糖的生物活性,但大部分研究均以桑叶粗提物为原料,且桑叶多酚降血糖的分子机制研究结果不尽统一。因此,本研究在分析6个代表性桑品种桑叶酚类单体组成的基础上,利用大孔吸附树脂建立了桑叶多酚富集工艺条件,制备桑叶多酚精制物。以碳水化合物消化吸收的关键酶-二糖酶为研究对象,探究桑叶多酚对不同来源二糖酶的抑制作用,并且通过建立Caco-2单层细胞肠道吸收模型来探究其对葡萄糖转运的影响并初步探讨其作用机制。1、不同桑品种的桑叶总多酚及单体酚类物质分析。通过高效液相色谱外标法,系统分析并比较了大10、抗青10号、阿2、69、农桑14、粤桑11号6个品种桑叶的多酚单体。结果发现,6个品种的桑叶均检测到绿原酸、香草酸等12种酚类单体,仅阿2检测到没食子酸,不同品种桑叶酚类单体组成差异明显。按各品种单体酚含量总和计,多酚含量由高至低排列顺序为:阿269抗青10号大10农桑14粤桑11,由于阿2和69均不是生产上广泛栽培的品种,产量有限,因此选择生产用品种抗青10号进行后续实验。2、桑叶多酚富集工艺优化。以桑叶多酚富集效果为考查指标,筛选出吸附和解吸能力最佳的D101型树脂,建立了分离纯化桑叶多酚的最佳工艺:进料液多酚浓度1mg/mL、pH 3.0、上样流速1 mL/min、上样量11BV,吸附结束后,先采用1 BV10%的乙醇进行部分去杂,然后分别用3 BV30%乙醇和3 BV50%的乙醇以1 mL/min的流速洗脱收集。纯化后,总酚纯度由纯化前的20.03%提高到75.67%。3、桑叶多酚对二糖酶的抑制作用。桑叶多酚对小鼠来源和Caco-2细胞来源的二糖酶均具有强烈的抑制作用,且随着桑叶多酚浓度的增加,抑制作用逐渐增强,其半数抑制浓度IC50值排序顺序为:鼠源蔗糖酶鼠源麦芽糖酶Caco-2细胞麦芽糖酶Caco-2细胞蔗糖酶,桑叶多酚对Caco-2细胞上蔗糖酶的抑制作用最强。对小鼠来源的酶,桑叶多酚对麦芽糖酶的抑制作用更强,即主要是通过抑制麦芽糖酶活性而起到改善血糖的作用;对来自Caco-2细胞的酶,桑叶多酚对蔗糖酶的抑制作用更强,即主要是通过抑制蔗糖酶活性而起到改善血糖的作用。4、桑叶多酚对Caco-2细胞葡萄糖转运的影响。通过建立Caco-2单层细胞模型模拟人体小肠对葡萄糖的转运,结果发现,在0.5-2 mg/mL浓度范围内,桑叶多酚能够显著抑制葡萄糖的转运,并且随着孵育时间的延长和多酚浓度的增大,其抑制率也增大。根皮苷(SGLT1抑制剂)对照组对葡萄糖转运的影响也呈现同样的趋势,这揭示了桑叶多酚可能主要是通过抑制SGLT1从而发挥抑制葡萄糖转运的作用。荧光定量PCR结果显示:桑叶多酚对SGLT1、GLUT2、PLC、PKA、PKC的基因表达均呈现抑制作用。在基因水平上推测其可能的信号通路为:桑叶多酚通过下调PLC和PKA的表达,PLC进而下调PKC的表达,PKC和PKA共同下调SGLT1的表达,PKC激活GLUT2转移至顶膜发挥葡萄糖转运的作用也降低,从而降低机体对葡萄糖的吸收。
【学位授予单位】：广东海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S888.2;R285
【图文】：

膳食,多酚

1.1 植物多酚的种类和分布多酚是植物中分布广泛、种类繁多的代谢产物，基本化学结构特征是苯酚与一个或多个羟基基团相连形成的共轭结构。已经报道的植物多酚类化合物种类繁多，从简单的小分子酚酸到分子量大于30,000Da的高度聚合化合物均可归于酚类物质[1]，按化学结构的差异可分为酚酸类、黄酮类、二苯乙烯、香豆素、单宁等5大类。咖啡酸是酚酸类化合物的代表性单体，在诸多蔬菜和水果中均有分布。另一种常见的酚酸是阿魏酸，可经酯化反应结合在阿拉伯木聚糖和半纤维素的侧链残基上，主要存在于谷物外壳部分。黄酮类化合物的结构特征是2个芳香环和3个碳原子结合在一起形成的含氧杂环，根据杂环的类型可分为6类：黄酮、黄烷酮、黄烷醇、黄酮醇、花青素和异黄酮。最常见的黄酮类是槲皮素，是广泛存在于洋葱、茶叶、水果的黄酮醇类；儿茶素是常见于于茶和水果中的黄烷醇类；橙色素，广泛分布于于柑橘类水果中，属于黄烷酮类；矢车菊素是一种常见的花色素，赋予黑醋栗，覆盆子，草莓等水果鲜艳的颜色，不同水果中含量各不相同。豆类及豆制品中存在大量的异黄酮类，如黄豆苷元、染料木黄酮，因其与雌激素有相似结构，又被称为植物雌激素[2]。

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可为高效开发降血糖产品提供理论依据，有助于桑叶资源的精深利用。1.5 主要研究内容研究内容主要分四个部分，研究技术路线见图1-2。（1）不同桑品种的桑叶总多酚及单体酚类物质分析。通过高效液相色谱法外标法，系统分析测定大 10、抗青 10 号、阿 2、69、农桑 14、粤桑 11 号 6 个代表性品种桑叶的多酚单体组成和含量差异，并且筛选出合适的品种进行后续实验。（2）桑叶多酚富集工艺优化。筛选适合桑叶多酚分离的大孔树脂类型，优化大孔树脂吸附和解吸最佳工艺参数，分析纯化前后桑叶多酚单体组成变化。（3）桑叶多酚对二糖酶的抑制作用研究。分别探讨桑叶多酚提取物对小鼠肠道来源的蔗糖酶和麦芽糖酶、Caco-2 细胞上的蔗糖酶和麦芽糖酶的抑制作用。（4）桑叶多酚对葡萄糖转运的影响。通过 Caco-2 单层细胞肠道吸收模型研究桑叶多酚提取物对 Caco-2 细胞上葡萄糖转运的影响，推测其主要影响的葡萄糖转运蛋白。明确了桑叶多酚通过影响 SGLT1、GLUT2、PKA、PKC、PLC 等关键细胞因子抑制葡萄糖吸收的调控通路，初步探明桑叶多酚在二糖消化过程中的分子机制。图 1-2 主要研究路线Fig 1-2 Main research route

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