PM2.5对血管内皮细胞氧化应激和凋亡的影响及丹参酮IIA磺酸钠的保护作用

发布时间：2020-06-26 14:48

【摘要】：目的采用脐静脉血管内皮融合细胞EA.hy926作为毒性研究评价模型,观察大气污染细颗粒物PM2.5对血管内皮细胞氧化应激和凋亡的影响。研究PM2.5对血管内皮细胞的毒性作用,揭示PM2.5引起血管内皮细胞损伤凋亡的可能原因;观察丹参酮IIA磺酸钠(STS)对PM2.5诱导的血管内皮细胞氧化应激凋亡的影响作用,从其对血管内皮细胞的直接影响探讨传统中医药丹参酮IIA对其的保护作用机制。方法1)PM2.5染毒后EA.hy926细胞活性的检测取对数生长期、生存状态良好的EA.hy926细胞,以8×10~3每孔接种于96孔板,分为对照组和不同浓度PM2.5染毒组(PM2.5终浓度分别为12.5、25、50、100和200μg/m L),每组设6个复孔。根据实验分组,对细胞进行染毒,24 h后按照CCK-8试剂盒说明书,10μmol/孔避光加入试剂,培养箱培养2 h,用酶标仪在450 nm处检测各孔吸光度值,按公式计算细胞存活率和半数致死量,以确定后续实验浓度。细胞存活率(of control%)=染毒组OD值/对照组OD值平均值×100%。2)PM2.5染毒后细胞内氧自由基的检测将细胞分为对照组、不同浓度PM2.5染毒组(PM2.5浓度根据细胞存活率及半数致死量结果选择25、50和100μg/mL)和N-乙酰半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine,NAC)处理组(以NAC 10 mmol/mL预处理1 h后加入PM2.5 100μg/m L)培养至贴壁。细胞以1×106每孔接种于6孔板,分组和处理同上,24 h后去除培养基,加入DCFH-DA探针(10μmol/L)孵育90 min,用温PBS漂洗2次,然后用温无血清培养基继续培养30 min,置于荧光显微镜下观察拍照。3)PM2.5染毒后流式细胞术检测细胞凋亡细胞分组和处理同上,孵育24 h后用无EDTA胰酶消化细胞,冷PBS离心洗涤2次,然后用400μLBinding Buffer重悬细胞,先加入Annexin V-FITC 5μL 4℃避光孵育15 min,再加入碘化丙啶(PI)10μL4℃避光孵育5 min后,用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。4)PM2.5染毒后细胞凋亡相关信号分子的检测细胞分组和处理同上,24 h后用冷PBS洗涤3次,用含PMSF的RIPA细胞裂解液冰上裂解细胞30 min,然后4℃、12500 g离心5 min,收集上清液,用BCA法测量蛋白浓度。取30μg蛋白进行SDS-PAGE电泳、转膜和Western blot。Western blot主要步骤如下:5%脱脂牛奶室温封闭1 h,TBST清洗10 min×3次,加入相应一抗(1:1000),4℃孵育过夜,TBST清洗后加入酶标二抗(1:3000),室温孵育1 h,最后用TBST清洗并用ECL法显色,凝胶成像系统拍照,用Image-J分析软件分析条带的灰度值,用目标蛋白与β-actin灰度值的比值来表示蛋白的相对表达水平。5)STS对细胞活性的影响取对数生长期的EA.hy926细胞,以8×10~3/孔接种96孔板,分为对照组、PM2.5 100μg/m L组和不同浓度STS组(终质量浓度分别为12.5、25、50μg/m L的STS预处理2 h后加入PM2.5 100μg/mL),每组5个复孔。细胞按照分组给予不同处理,24 h后参考CCK-8试剂盒说明书进行处理,用酶标仪在450 nm处检测各孔吸光度值(A),按公式计算细胞存活率。细胞存活率=加药组吸光度值/阴性对照组吸光度值×100%。6)STS对染毒PM2.5 EA.hy926细胞氧化应激和凋亡的影响细胞分组和处理同上,孵育24 h后去除培养基,采用DCFH-DA荧光探针法监测PM2.5刺激24 h后EA.hy926细胞ROS生成情况;采用FITC/PI双染监测细胞的凋亡情况;采用Western Blot法监测PM2.5作用24小时后EA.hy926细胞相关凋亡蛋白Caspase-9、Caspase-3的蛋白表达情况。结果1)PM2.5对EA.hy926细胞的毒性作用当PM2.5浓度为12.5μg/mL时,EA.hy926细胞的存活率虽然有所降低,但与对照组无显著性差异;当PM2.5浓度大于25μg/mL时,EA.hy926细胞存活率明显下降,与对照组相比差异有统计学显著性。2)PM2.5对EA.hy926细胞氧化损伤的作用荧光染色结果显示,相比对照组细胞,PM2.5刺激后细胞内可见较强的荧光,且随着PM2.5浓度的增大荧光强度逐渐增加。以抗氧化剂NAC预处理后细胞内荧光强度明显减弱,说明NAC可减少PM2.5诱导的ROS生成。3)染毒后流式细胞术检测细胞凋亡检测结果显示PM2.5作用于EA.hy926细胞后,凋亡细胞数增多,并呈浓度依赖性增加;实验还显示用NAC预处理后再给予PM2.5染毒可以减轻细胞凋亡,与对应浓度的PM2.5组比较细胞凋亡率明显下降。4)PM2.5对相关凋亡相关信号分子的影响与对照组相比,PM2.5可使EA.hy926细胞胞浆中的Cyt-C含量明显增高,同时活化的caspase-3、caspase-9增加,用NAC干预后Cyt-C蛋白表达明显降低,同时活化的caspase-3、caspase-9表达降低,说明NAC可下调凋亡蛋白表达。5)STS对细胞活性的影响100μg/mLPM2.5染毒可使EA.hy926细胞活性明显下降,与对照组有显著性差异。而STS组细胞活性较PM2.5组显著增高,说明STS预处理可以减轻PM2.5对血管内皮细胞的毒性。6)STS对染毒PM2.5 EA.hy926细胞氧化损伤和凋亡的影响荧光染色结果显示,经PM2.5刺激后荧光强度明显增强;在不同浓度STS组中,细胞内的荧光强度较PM2.5组明显降低;流式细胞仪检测显示与对照组比较,PM2.5染毒后EA.hy926凋亡率明显增加,而加入STS预处理后再给予PM2.5染毒则血管内皮细胞的凋亡率显著降低,与PM2.5阳性对照组比较P0.5;PM2.5作用于EA.hy926细胞后,活化的Caspase-9和Caspase-3增加;用STS预处理可以抑制PM2.5引起的Caspase-9和Caspase-3激活。结论:1)PM2.5染毒可导致血管内皮细胞氧化应激水平增强和凋亡增加,这可能是其影响心血管系统功能的机制之一。2)丹参酮IIA磺酸钠可以减少PM2.5引起的血管内皮细胞凋亡,其保护作用可能与抑制氧自由基生成有关。
【学位授予单位】：广东药科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R285.5
【图文】：

细胞活力,存活率,药科大学

广东药科大学硕士研究生学位论文分析系统进行拍照，用凝胶图像处理系统对目的条带的分子量以及净说明书进行分析。统计学分析以 Graphpad Prism 5.0 统计软件进行分析，数据以 X±SD）表示，多样本组间比较采用单因素方差分析（One-Way A计分析，P<0.05 时被认为具有统计学意义。结果1 PM2.5 对 EA.hy926 的毒性作用图一可见，随着 PM2.5 浓度的逐渐增大，EA.hy926 细胞的存活率依.5 浓度为 12.5 μg/mL 时，细胞的存活率虽然有所降低，但与对照组异；当 PM2.5 浓度大于 25 μg/mL 时，EA.hy926 细胞存活率明显下降有统计学显著性差异。（见图 1）

【参考文献】