黄蜀葵花总黄酮通过NF-κB信号通路调控自噬治疗克罗恩病的作用机制研究
发布时间：2020-06-29 08:45
【摘要】：克罗恩病(CD)是临床难治性疾病之一。研究表明,NF-κB信号通路调控炎症细胞因子的释放是CD发生的关键机制和重要的治疗靶点,自噬是细胞新陈代谢的一个重要过程,而通过对自噬通路的调控达到改善CD进程也是目前研究的热点,和炎症相关的的NF-κB信号通路证实和自噬相关,在CD发病过程中具有重要作用,中医药在CD治疗中有独特疗效,本研究在进一步明确黄蜀葵花总黄酮(TFA)治疗CD疗效的同时,对其治疗机制进行探讨。目的:1.在动物水平,观察TFA对CD模型小鼠结肠炎症的改善,对炎症因子TNF-α、IFN-γ、IL-6、IL-1β、IL-12和IL-17表达量的影响,结肠组织自噬体的变化及自噬相关蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin-1、p62,NF-κB通路标志蛋白p-IKKα/β/γ、IκBα p-p65、p100、p52蛋白表达量的影响。2.在细胞水平,探讨TFA通过对NF-κB自噬通路的调控,对于RAW264.7细胞自噬水平的影响及对NF-κB信号通路的影响。方法:1.通过TNBS建立CD小鼠模型,通过对各组小鼠一般情况,DAI评分,镜下病理评分和Mαsson染色等评估各组小鼠结肠组织炎症水平及肠纤维化水平,运用ELISA检测TNF-α、IFN-γ、IL-6、IL-1β、IL-12和IL-17含量。2.运用透射电镜观察结肠组织中自噬体的变化,Western-Blot、免疫荧光等方法观察小鼠结肠组织自噬相关蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin-1、p62,NF-κB通路标志蛋白p-IKKα/β/γ、IκB、p65、p100、p52蛋白表达量。3.采用体外培养的RAW264.7细胞,通过CCK-8实验筛选出不同浓度TFA对LPS刺激的RAW264.7细胞进行干预,并加入通路抑制剂PDTC,采用ELISA检测体外实验中各组细胞TNF-α、IFN-γ、IL-6、IL-1β、IL-12和IL-17含量,Western-Blot、免疫荧光等方法观察小鼠结肠组织自噬相关蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin-1、p62,NF-κB通路标志蛋白p-IKKα/β/γ、IκB、p65、p100、p52蛋白表达量。结果:1.TNBS诱导CD小鼠相比较正常对照组,小鼠死亡率、结肠重量/长度比升高,小鼠体重,DAI评分显著下降,病理评分、纤维化评分显著升高,结肠组织中TNF-α、IFN-γ、IL-6、IL-1β、IL-12和IL-17等促炎细胞因子含量升高(P0.05);和模型组比较,SASP组和TFA各剂量组小鼠死亡率、结肠重量/长度比均降低,DAI评分、体重均升高,病理、纤维化评分均下降(P0.05),TNF-α,IFN-γ,IL-6,IL-1β,IL-12和IL-17等促炎细胞因子含量升高(P0.05)。其中,小鼠死亡率的减少、体重的增加、结肠重量/长度比值的降低程度、结肠组织TNF-α,IFN-γγ,IL-6,IL-1β,IL-12和IL-17表达量和TFA呈剂量依赖关系。2.和正常对照组相比,CD模型小鼠结肠组织p-IKKα/β/γ、IκB、p65、p100、p52蛋白含量升高,p100、p52含量降低,透射电镜下结肠组织双层膜囊泡结构的自噬体减少,标志性蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin-1降低、p62升高(P0.05)。和模型组比较,SASP组、TFA各剂量组小鼠结肠组织中p-IKKα/β/γ、IκB、p65、p100、p52蛋白含量降低,p100、p52含量升高,透射电镜下自噬体增多,LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin-1含量增加,p62含量减少(P0.05),且各组变化程度和TFA呈剂量依赖关系。3.使用CCK-8测定评估TFA毒性,TFA在200μg/mL的剂量下没有细胞毒性,LPS显著促进RAW264.7中炎症细胞因子水平,包括TNF-α,IFN-y,IL-6,IL-1β,IL-12和IL-17较正常组均升高(P0.05)。SASP、TFA降低了LPS诱导的巨噬细胞RAW264.7细胞中炎症细胞因子的产生。和正常组比较,LPS处理后p-IKKα/β/γ,IκBα和p-p65的表达显著增加,p100、p52表达量下降(P0.05);和LPS组相比,LPS+TFA组、LPS+PDTC组、LPS+TFA+PDTC组p-IKKα/β3/y,IκBα和p-p65表达量均下降,p100、p52表达量均上升(P0.05);和LPS+TFA组相比,LPS+PDTC组、LPS+TFA+PDTC组p-IKKα/β/γ,IκBα和p-p65表达量均有升高,p100、p52表达量均下降(P0.05);和LPS+PDTC组相比,LPS+TFA+PDTC组p-IKKα/β/γ、IκBα、p-p65、p100、p52表达量未见明显变化。4.LPS刺激RAW264.7后LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、beclin-1较正常组显著减少,p62显著增加(P0.05);在LPS刺激基础上,予TFA干预后发现LC3 Ⅱ/LC3Ⅰ、beclin-1显著增加,p62显著下降(P0.05);给予LPS和PDTC刺激后LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、beclin-1较LPS+TFA组、LPS组显著下降,p62较LPS+TFA组、LPS组显著升高(P0.05);同时给予LPS、TFA、PDTC后LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、beclin-1相较于LPS组、LPS+TFA组显著减少(P0.05),p62较LPS组、LPS+TFA组显著升高;LPS+TFA+PDTC组和LPS+PDTC组间未见明显差异。结论:1.TFA具有降低CD模型小鼠结肠组织和血清中TNF-α,IFN-y,IL-6,IL-1β,IL-12和IL-17炎症因子含量,减轻CD小鼠临床症状,改善其肠道炎症程度,且和TFA呈剂量依赖关系。2.TFA能够抑制NF-κB通路相关蛋白表达,激活CD模型小鼠结肠自噬表达,增加自噬相关标志蛋白表达水平。3.NF-κB通路对RAW264.7细胞的自噬水平具有抑制作用,TFA可能通过抑制NF-κB信号通路传导激活自噬达到缓解巨噬细胞炎症的作用。
【学位授予单位】：南京中医药大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R285.5
【图文】：
发生发展提供新的解释机制，ｍＴＯＲ抑制剂可能为炎症性肠病的治疗提供新思路。逡逑（３）邋ＰＩ３Ｋ７Ａｋｔ：邋ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ存在于许多细胞的代谢中，同时有关键功效，ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ信逡逑号传导通道被激活，从而调节细胞增殖，分化，凋亡和自噻１７２］。其激活途径如
逑据胶原面积比例，测定得出百分比，依据镜下表现评估出纤维化指数逡逑图２．４纤维化指数评分步骤逡逑纤维化指数标准如表２．３所示。逡逑逦表２．３纤维化指数评分标准逦逡逑逦＃１逦得分逡逑未见纤维化逦０逡逑黏膜及黏膜下见胶原沉积，但未见结构变形逦１逡逑黏膜及黏膜下见较多胶原沉积，伴轻度组织结构改变，但未见黏膜及黏膜下逦２逡逑界消失逡逑黏膜及黏膜下见大量胶原沉积，伴组织结构扭曲及界限消失逦３逡逑２．５．７邋Ｅｌｉｓａ方法检测小鼠结肠组织及血清中炎症相关细胞因子逡逑２．５．７．１邋试齐ｉｊ逡逑（１）将５０ｍＬ２0ｘＷａｓｈ邋Ｂｕｆｆｅｒ溶液加到１０００ｍｌ的量筒中，再慢慢注入去离子水直至逡逑１０００ｍｌ，轻轻摇晃使其能够均R诤希粮删徊Ａ坷铮
本文编号：2733671
【学位授予单位】：南京中医药大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R285.5
【图文】：
发生发展提供新的解释机制，ｍＴＯＲ抑制剂可能为炎症性肠病的治疗提供新思路。逡逑（３）邋ＰＩ３Ｋ７Ａｋｔ：邋ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ存在于许多细胞的代谢中，同时有关键功效，ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ信逡逑号传导通道被激活，从而调节细胞增殖，分化，凋亡和自噻１７２］。其激活途径如
逑据胶原面积比例，测定得出百分比，依据镜下表现评估出纤维化指数逡逑图２．４纤维化指数评分步骤逡逑纤维化指数标准如表２．３所示。逡逑逦表２．３纤维化指数评分标准逦逡逑逦＃１逦得分逡逑未见纤维化逦０逡逑黏膜及黏膜下见胶原沉积，但未见结构变形逦１逡逑黏膜及黏膜下见较多胶原沉积，伴轻度组织结构改变，但未见黏膜及黏膜下逦２逡逑界消失逡逑黏膜及黏膜下见大量胶原沉积，伴组织结构扭曲及界限消失逦３逡逑２．５．７邋Ｅｌｉｓａ方法检测小鼠结肠组织及血清中炎症相关细胞因子逡逑２．５．７．１邋试齐ｉｊ逡逑（１）将５０ｍＬ２0ｘＷａｓｈ邋Ｂｕｆｆｅｒ溶液加到１０００ｍｌ的量筒中，再慢慢注入去离子水直至逡逑１０００ｍｌ，轻轻摇晃使其能够均R诤希粮删徊Ａ坷铮
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