ITP气不摄血证小鼠模型研究及益气摄血颗粒药效学探索

发布时间：2020-06-29 17:40

【摘要】：原发免疫性血小板减少症(primary immune thrombocytopenia,ITP)是一种国内外常见的自身免疫性疾病,部分患者面部、四肢、脏器等常有出血现象,出血程度严重时可威胁到生命。中医将ITP分为血热妄行证、瘀血内阻证、阴虚火旺证、气不摄血证4种证型,其中气不摄血证是中医临床上ITP最常见的证型。目前,ITP的发病机制尚未明确,其治疗方法也未能统一,若要解决这两个问题,相应的病证结合动物模型是深入研究的关键手段。因此,本课题在以往研究的基础上对ITP气不摄血证动物模型的制备方法进行了研究,并在此模型上对益气摄血颗粒(Yiqishexue Granules,YQSX)的药效学进行了初步探索。目的:模拟ITP气不摄血证患者的疾病和证候表现,建立ITP气不摄血证动物模型,并对此模型进行动态研究,阐明其病理变化的过程,此外在该模型上对益气摄血颗粒的药效学进行初步探索,为ITP气不摄血证的发病机制和治疗方法提供新的思路和途径。方法:1ITP气不摄血证小鼠模型的建立与评价采用腹腔注射抗血小板血清(anti-platelet serum,APS)复合睡眠剥夺的方法建立ITP气不摄血证小鼠模型。Balb/c小鼠随机分为3周(正常组、模型组)、4周(正常组、模型组)、5周(正常组、模型组),每组12只。3周模型组小鼠在第1周睡眠剥夺,第2、3周腹腔注射APS复合睡眠剥夺;4周模型组小鼠在第1、2周睡眠剥夺,第3、4周腹腔注射APS复合睡眠剥夺;5周模型组小鼠在第1、2、3周睡眠剥夺,第4、5周腹腔注射APS复合睡眠剥夺。实验结束后,通过检测小鼠外周血血小板(platelet,PLT)计数、出血情况、脾脏指数、脾脏T与B淋巴细胞亚群等相关疾病指标和体质量、抓力、脉搏幅度、舌象等相关证候指标,确定建立ITP气不摄血证小鼠模型的最佳周期及方法。2 ITP气不摄血证小鼠模型的动态研究在确定ITP气不摄血证小鼠模型的最佳造模周期(3周)与方法(第1周睡眠剥夺,第2、3周腹腔注射APS复合睡眠剥夺)的基础上,结合该模型特点选取7d、10d、21d 3个时间点进行动态观察。将Balb/c小鼠随机分为正常组(39只)、模型组(45只),第7d、10d、21d后各取一批小鼠进行指标检测,分别检测小鼠外周血PLT计数、出血分级、骨髓巨核细胞分类及计数、脾脏指数、脾脏病理、脾脏T与B淋巴细胞亚群、肺脏病理等相关疾病指标,体质量、抓力、脉搏幅度等相关证候指标,以及PLT形态、活化与功能、凋亡等相关指标。3益气摄血颗粒对ITP气不摄血证小鼠药效学的初步探索Balb/c小鼠随机分为正常组、模型组、YQSX高剂量组(15.22g生药/kg)、YQSX低剂量组(7.61g生药/kg)、醋酸泼尼松组,每组12只。第1次腹腔注射APS24h后开始灌胃给药,连续给药12d。各给药组给药体积均为20ml/kg/d;正常组、模型组小鼠给予等量的生理盐水。实验结束后,检测小鼠外周血PLT计数、出血分级、脾脏指数、胸腺指数、脾脏T与B淋巴细胞亚群等相关疾病指标,体质量、抓力、舌象等相关证候指标和血小板活化、凋亡相关指标。结果:1ITP气不摄血证小鼠模型的建立与评价(1)疾病指标与正常组比较,3周、4周、5周模型组小鼠均有不同程度的出血情况;外周血PLT计数均显著降低(P0.01);脾脏指数均显著增大(P0.01);3周、4周模型组小鼠胸腺指数无明显变化(P0.05),5周模型组小鼠胸腺指数显著减小(P0.01);CD3+T 细胞、CD4+T 细胞、CD8+T 细胞、CD4+/CD8+均显著降低(P0.05-0.01),3周模型组小鼠CD19+B细胞无明显变化(P0.05),4周、5周模型组小鼠CD19+B细胞明显降低(P0.05)。(2)证候指标正常组小鼠毛色亮白光润,大便黄褐色、成条状;3周、4周、5周模型组小鼠毛色粗糙暗黄、有眯眼与竖毛情况,大便黑褐色或湿便。与正常组比较,3周、4周、5周模型组小鼠体质量均无明显变化(P0.05);抓力均显著降低(P0.01);3周、5周模型组小鼠脉搏幅度显著降低(P0.01),4周模型组小鼠脉搏幅度无明显变化(P0.05);3周、4周、5周模型组小鼠舌面R、G、B、R/B值均无明显变化(P0.05),3周模型组小鼠舌面R/G值明显降低(P0.05)。2 ITP气不摄血证小鼠模型的动态研究(1)疾病指标与正常组比较,7d时模型组小鼠无出血情况、脾脏指数无明显变化(P0.05),10d、21d时模型组小鼠均有不同程度不同部位的出血现象、脾脏指数显著增高(P0.01);7d、10d、21d时模型组小鼠PLT计数均显著降低(P0.01);7d时模型组小鼠的颗粒巨、产板巨、巨核细胞总数明显降低(P0.05),10d时模型组小鼠的幼稚巨明显降低(P0.05),颗粒巨、裸核巨、巨核细胞总数均明显增高(P0.05),21d时模型组小鼠的幼稚巨、颗粒巨、裸核巨、巨核细胞总数均显著增高(P0.05-0.01);7d时模型组小鼠的CD3+T细胞显著增高(P0.01),10d、21d时显著降低(P0.01),7d、10d时模型组小鼠的CD4+T细胞均显著降低(P0.01),21d时无明显变化(P0.05),7d模型组小鼠的CD8+T细胞显著增高(P0.01),10d、21d时无明显差异(P0.05),7d、21d时模型组小鼠的CD19+B细胞显著增高(P0.01),10d时无明显变化(P0.05)。(2)证候指标正常组小鼠的毛色亮白、光润,大便黄褐色、成条状,精神状态良好,7d、10d、21d时模型组小鼠毛色较暗、粗糙,有眯眼与竖毛情况,大便黑褐色或湿便。与正常组比较,7d、10d、21d时模型组小鼠的体质量、抓力、脉搏幅度均显著降低(P0.01)。(3)PLT相关指标与正常组比较,7d、10d、21d时模型组小鼠TPO、TGF-β1、β-TG、PF4、ATP、ADP、CD62P、ROS-MFI 均显著增高(P0.05-0.01);7d、10d 时模型组小鼠△屮m显著降低(P0.01),21d时显著升高(P0.01);7d时模型组小鼠PNA、PMA均无明显变化(P0.05),10d时均显著降低(P0.01),21d时PNA明显增高(P0.05)、PMA显著降低(P0.01)。3益气摄血颗粒对ITP气不摄血证小鼠药效学的初步探索(1)疾病指标与正常组比较,模型组小鼠有出血现象;外周血中PLT计数显著下降(P0.01);脾脏指数显著增高(P0.01);胸腺指数无明显差异(P0.05);CD3+T 细胞显著下降(P0.01)、CD4+T 细胞、CD8+T 细胞、CD4+/CD8+、CD19+B细胞均无明显变化(P0.05)。与模型组比较,醋酸泼尼松组、YQSX高剂量组小鼠出血现象有不同程度的改善;YQSX高剂量组小鼠外周血中PLT计数明显增高(P0.05);醋酸泼尼松组小鼠脾脏指数、胸腺指数均显著降低(P0.01);醋酸泼尼松组小鼠CD3+T细胞、CD8+T细胞显著增高(P0.01),CD4+/CD8+显著下降(P0.01),CD4+T细胞、CD19+B细胞均无明显变化(P0.05)。(2)证候指标与正常组比较,模型组小鼠体质量无明显变化(P0.05);抓力显著下降(P0.01);R/G值明显降低(P0.05)。与模型组比较,醋酸泼尼松组、YQSX高、低剂量组体质量均无明显变化(P0.05);醋酸泼尼松组小鼠抓力无明显变化(P0.05),YQSX高、低剂量组明显升高(P0.05-0.01);醋酸泼尼松组、YQSX高、低剂量组小鼠R/G值无明显变化(P0.05)。(3)PLT相关指标与正常组比较,模型组小鼠CD62P、AV无明显变化(P0.05),但有明显升高趋势;与模型组比较,醋酸泼尼松组、YQSX低剂量组小鼠CD62P均无明显变化(P0.05),YQSX高剂量组明显降低(P0.05);YQSX高、低剂量组AV均无明显变化(P0.05),但有明显降低趋势。结论:1 ITP气不摄血证小鼠模型的最佳建立周期为3周,建立方法为第1周睡眠剥夺,第2、3周腹腔注射APS复合睡眠剥夺。2 ITP气不摄血证小鼠模型的病理变化为先形成气虚后出血又加重气虚的动态过程,符合中医气不摄血的病因病机。3益气摄血颗粒可提高ITP气不摄血证小鼠的抓力和外周血小板计数,抑制血小板活化,对其疾病和证候的主要指标有改善作用。
【学位授予单位】：中国中医科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R285.5;R-332
【图文】：

图１－１小鼠外周血ＰＬＴ计数（ｆ±５，《）逡逑与正常组比较，＊Ｐ＜０．０５，＊＊尸＜０．０１逡逑

ITP气不摄血证小鼠模型研究及益气摄血颗粒药效学探索

图１－２模型组小鼠出血的部位逡逑３．１．３小鼠脏器指数逡逑

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