【摘要】：[目的]探讨槲皮素、齐墩果酸和淫羊藿苷及其配伍对高糖培养SD大鼠海马神经元凋亡、p38 丝裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinases,p38MAPK)和c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)信号通路的影响。[方法]取新生24h SD大鼠的海马组织,采用消化法对海马神经元进行分离,密度梯度离心法和差速贴壁法进行纯化,神经元特异性烯醇化酶(neuron-specific enolase,NSE)蛋白免疫荧光法进行纯度鉴定。设置正常组葡萄糖(glucose,Glu)浓度为25mmol/L,高糖组Glu浓度为50mmol/L,p38MAPK 通路抑制剂 SB239063 为 10μmol/L,JNK通路抑制剂 SP600125为 lOμmol/L。在50mmol/L Glu的高糖培养基中,分别加入不同浓度梯度的槲皮素、齐墩果酸、淫羊藿苷,利用细胞增殖-毒性检测试剂盒(Cell Counting Kit-8,CCK-8)摸索各药物最佳作用浓度及其对高糖培养下海马神经元相对活性的影响。采用流式细胞仪检测正常组、高糖组、槲皮素组、齐墩果酸组、淫羊藿苷组、槲皮素+齐墩果酸组、槲皮素+淫羊藿苷组、齐墩果酸+淫羊藿苷组、槲皮素+齐墩果酸+淫羊藿苷组、p38MAPK抑制剂组、JNK抑制剂组神经元的凋亡。Western Blot检测各组神经元p-p38、p38、p-JNK和JNK蛋白的表达。[结果]1.成功培养海马神经元,经鉴定纯度为97.2±1.1%。2.CCK-8探索各药物最佳作用浓度及其对高糖条件下海马神经元相对活性的影响:与正常组相比,高糖组神经元相对活性降低(P0.01);与高糖组相比,槲皮素10-5mol/L、齐墩果酸10-6mol/L,淫羊藿苷105mol/L组神经元相对活性均升高(P0.01),选为最佳作用浓度。3.流式细胞仪检测细胞凋亡:与正常组相比,高糖组神经元凋亡率增加(P0.01);与高糖组相比,其余各组神经元凋亡率均减少(P0.01);槲皮素组、齐墩果酸组、淫羊藿苷组、p38MAPK抑制剂组、JNK抑制剂组组间比较凋亡率无显著差异(P0.05)。分别与槲皮素组、齐墩果酸组、淫羊藿苷组相比,槲皮素+齐墩果酸组、槲皮素+淫羊藿苷组、齐墩果酸+淫羊藿苷组、槲皮素+齐墩果酸+淫羊藿苷组神经元凋亡率均减少(P0.01);分别与槲皮素+齐墩果酸组、槲皮素+淫羊藿苷组、齐墩果酸+淫羊藿苷组相比,槲皮素+齐墩果酸+淫羊藿苷组神经元凋亡率减少(P0.05);槲皮素+齐墩果酸组、槲皮素+淫羊藿苷组、齐墩果酸+淫羊藿苷组组间比较凋亡率无显著差异(P0.05)。4.Western Blot检测蛋白表达:与正常组相比,高糖组p-p38/p38比值增加(P0.01);与高糖组相比,槲皮素组、齐墩果酸组、淫羊藿苷组、槲皮素+齐墩果酸组、槲皮素+淫羊藿苷组、齐墩果酸+淫羊藿苷组、槲皮素+齐墩果酸+淫羊藿苷组、p38MAPK抑制剂组p-p38/p38比值减少(P0.01),JNK抑制剂组p-p38/p38比值增加(P0.01);与p38MAPK抑制剂组相比,槲皮素组、齐墩果酸组、淫羊藿苷组、JNK抑制剂组p-p38/p38比值增加(P0.01)。分别与槲皮素组、齐墩果酸组、淫羊藿苷组相比,槲皮素+齐墩果酸组、槲皮素+淫羊藿苷组、齐墩果酸+淫羊藿苷组、槲皮素+齐墩果酸+淫羊藿苷组p-p38/p38比值减少(P0.01)。槲皮素+齐墩果酸组、槲皮素+淫羊藿苷组、齐墩果酸+淫羊藿苷组、槲皮素+齐墩果酸+淫羊藿苷组组间比较无显著性差异(P0.05)。与正常组相比,高糖组p-JNK/JNK比值增加(P0.01);与高糖组相比,槲皮素组、齐墩果酸组、淫羊藿苷组、槲皮素+齐墩果酸组、槲皮素+淫羊藿苷组、齐墩果酸+淫羊藿苷组、槲皮素+齐墩果酸+淫羊藿苷组、p38MAPK抑制剂组、JNK抑制剂组p-JNK/JNK比值减少(P0.01);与JNK抑制剂组相比,槲皮素组、齐墩果酸组、淫羊藿苷组、p38MAPK抑制剂组p-JNK/JNK比值增加(P0.01)。分别与槲皮素组、齐墩果酸组、淫羊藿苷组相比,槲皮素+齐墩果酸组、槲皮素+淫羊藿苷组、齐墩果酸+淫羊藿苷组、槲皮素+齐墩果酸+淫羊藿苷组p-JNK/JNK比值减少(P0.01)。与槲皮素+齐墩果酸组相比,槲皮素+淫羊藿苷组、齐墩果酸+淫羊藿苷组p-JNK/JNK比值增加(P0.01),槲皮素+齐墩果酸+淫羊藿苷组p-JNK/JNK比值减少(P0.01);与槲皮素+淫羊藿苷组相比,齐墩果酸+淫羊藿苷组p-JNK/JNK比值增加(P0.01),槲皮素+齐墩果酸+淫羊藿苷组p-JNK/JNK比值减少(P0.01);与齐墩果酸+淫羊藿苷组相比,槲皮素+齐墩果酸+淫羊藿苷组p-JNK/JNK比值减少(P0.01)。[结论]1.高糖条件下,海马神经元凋亡增加,p-p38/p38、p-JNK/JNK比值较正常组明显升高,提示高糖环境可以将p38MAPK和JNK信号通路激活。2.槲皮素、齐墩果酸、淫羊藿苷均能够减少高糖培养下海马神经元的凋亡,降低p38MAPK和JNK信号通路中p38和JNK蛋白的磷酸化水平。3.与单体相比,槲皮素、齐墩果酸、淫羊藿苷相互配伍后能进一步减少高糖培养下海马神经元的凋亡,降低p38MAPK和JNK信号通路中p38和JNK蛋白的磷酸化水平。[创新点]以单体槲皮素、齐墩果酸、淫羊藿苷相互配伍对高糖条件下海马神经元进行干预,并从p38MAPK和JNK信号通路对其进行凋亡机制的研究。
【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R285.5
【图文】：
逦北京协和医学院中国医学科学院逦硕士研宄生学位论文逦逡逑海马组织中淀粉样前体蛋白（ａｍｙｌｏｉｄ邋ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ邋ｐｒｏｔｅｉｎ，邋ＡＰＰ）、早老素１邋（ｐｒｅｓｅｎｉｌｉｎ邋１，逡逑ＰＳ１）的表达，抑制（３－淀粉样蛋白（ａｍｙｌｏｉｄｐ－ｐｒｏｔｅｉｎ，邋Ａｐ）形成［３６’３７］实现的。淫羊逡逑藿苷具有改善阿尔茨海默病（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒｄｉｓｅａｓｅ，ＡＤ）模型小鼠学习记忆能力、调节逡逑细胞内钙稳态、抑制ｔａｕ蛋白磷酸化及ＡＰ的生成、抗氧化应激［３８４１］等能力。逡逑本实验拟观察菟丝子、女贞子和淫羊藿提取物及其配伍对高糖环境下海马神经逡逑元凋亡及Ｐ３８ＭＡＰＫ和ＪＮＫ信号通路的影响，为明确上述药物配伍后作用及进一步逡逑优化临床处方提供实验依据。逡逑
逦北京协和医学院中国医学科学院逦硕士研宄生学位论文逦逡逑海马组织中淀粉样前体蛋白（ａｍｙｌｏｉｄ邋ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ邋ｐｒｏｔｅｉｎ，邋ＡＰＰ）、早老素１邋（ｐｒｅｓｅｎｉｌｉｎ邋１，逡逑ＰＳ１）的表达，抑制（３－淀粉样蛋白（ａｍｙｌｏｉｄｐ－ｐｒｏｔｅｉｎ，邋Ａｐ）形成［３６’３７］实现的。淫羊逡逑藿苷具有改善阿尔茨海默病（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒｄｉｓｅａｓｅ，ＡＤ）模型小鼠学习记忆能力、调节逡逑细胞内钙稳态、抑制ｔａｕ蛋白磷酸化及ＡＰ的生成、抗氧化应激［３８４１］等能力。逡逑本实验拟观察菟丝子、女贞子和淫羊藿提取物及其配伍对高糖环境下海马神经逡逑元凋亡及Ｐ３８ＭＡＰＫ和ＪＮＫ信号通路的影响，为明确上述药物配伍后作用及进一步逡逑优化临床处方提供实验依据。逡逑
【参考文献】
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本文编号：
2735126
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