成纤维细胞生长因子9在红花中的表达、活性及药效学初步研究

发布时间：2020-07-04 04:18

【摘要】：成纤维细胞生长因子9(FGF9)是FGFs家族中的一种分泌型蛋白,由间皮细胞和上皮细胞分泌,具有骨骼发育、组织修复、毛发再生等多种生物学活性。FGF9的研究从癌症、骨骼相关疾病、性腺分化等的透彻机理机制到骨关节炎治疗、促进毛发生长与创伤修复的作用机理,临床应用及需求的逐步加大。植物油体融合技术的广泛应用,且红花作为生物反应器生产药物蛋白已成为研究热点。本实验通过红花表达oleosin-rhFGF9重组蛋白,获得稳定遗传的红花植株,进行生物学活性和初步药效学分析,主要研究结果如下:1.通过冻融法将鉴定的pOTBar-oleosin-rhFGF9质粒转入农杆菌EHA105中,农杆菌介导法将oleosin-rhFGF9基因转入红花子叶中,经红花组织培养、Basta筛选获得转基因再生苗,嫁接法,PCR验证,扩繁,获得转基因T_3红花种子。2.通过Western blot定性分析及ELISA定量分析,oleosin-rhFGF9融合蛋白含量为0.13%。MTT法检测生物学活性,浓度为60 ng·mL~(-1)时,转基因红花油体促NIH/3T3细胞增殖较好,且有一定剂量依赖性。3.建立C57BL/6小鼠脱发模型,小鼠毛发生长状况及HE染色、新生毛发数表明各组小鼠毛发长势良好,其中高剂量组小鼠毛发浓密,阳性组促进毛发生长效果类似,新生毛发数均较空白组有显著效果;免疫组织化学染色和皮肤组织总蛋白的WB分析,表明高剂量组、阳性组的β-catenin表达较空白组有显著性差异,与毛发生长状况呈一定相关性。4.建立C57BL/6小鼠创伤模型,小鼠创口愈合情况,HE染色,Masson染色及创口愈合率表明各组小鼠创伤愈合明显,阳性组、高剂量组、低剂量组愈合效果较空白组均显著,且在第5 d,高剂量组愈合效果显著优于阳性组。
【学位授予单位】：吉林农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R285.5
【图文】：

农杆菌转化,PCR鉴定

箱中培养 24 h。根据 ELASA 定量的结果，选取转基因及野生型红花种子 2-3 粒中提取油体，先将种子用 75%酒精进行表面消毒处理，使用的 PBS 缓冲液、手棒、离心管等均为灭菌消毒，离心法提取纯化获得红花种子油体蛋白。用 DE体蛋白，设阳性孔（bFGF 标准品）、野生型红花油体总蛋白孔及转基因红花油体，按 0.94~120 ng·mL-1各 9 个浓度倍比稀释，每孔加 100 μL，可设复孔。96 孔板细胞依照如上所述进行上样，于 37℃、5% CO2培养箱培养 48 h。取出 96 孔板入配制好的 20 μL MTT（5 g·L-1）溶液混匀，培养 4 h 后，弃掉培养基，每孔加 O，振荡混匀，酶标仪测量 570/630 nm 处的吸光度。结果农杆菌的转化鉴定pOTBar-oleosin-rhFGF9 质粒通过冻融法转入 EHA105 农杆菌感受态中，28℃培平板上长出的单菌落，摇菌，PCR 验证，1%琼脂糖凝胶电泳见图 1.1，如图所道有条带，且条带位置与阳性对照一致，空白对照的 2 号泳道处没有条带，Bar-oleosin-rhFGF9 质粒已经成功转入农杆菌感受态。

流程图,红花,流程,基因组

图 1.2 农杆菌介导的红花转化流程Fig.1.2 Agrobacterium mediated transformation of safflower发；B.农杆菌侵染；C.共培养；D.芽分化；E.再生苗；F.砧木和接穗；G.嫁接；H.练基因红花的 PCR 检测no Drop 测定红花植株基因组浓度为 200-400 ng·μL-1，A260/A280 均在量较好。红花基因组作为模板，进行 PCR 反应，琼脂糖凝胶电泳分析， 14 株与阳性对照一致的条带，空白对照和阴性对照均无条带，其中 6 个条转化红花子叶 1752，转化率为 0.8%。

【参考文献】