脉抒及虫草素衍生物IMM-H007改善实验性脂代谢紊乱和受累器官损害作用研究

发布时间：2020-07-04 23:42

【摘要】：研究背景近年来随着经济的发展,人们生活方式发生了较大的变化,大量高能量、高脂和高糖食物的摄入使得高脂血症的发病率逐年增高并伴有低龄化趋势,高脂血症是血清中的胆固醇(total cholesterol,TC)、甘油三酯(triglyceride,TG)、低密度脂蛋白胆固醇(low density lipoprotein cholesterol,LDL-C)含量过高和高密度脂蛋白胆固醇(high density lipoprotein cholesterol,HDL-C)水平过低的一种脂代谢紊乱性疾病,若不进行有效干预,可成为诱发高血压、高血黏度、脂肪肝、动脉粥样硬化甚至冠心病及脑卒中等一系列严重疾病的危险因素。目前市场上治疗高脂血症的药物主要是他汀和贝特类,其不良反应对患者影响严重,因此寻找安全、有效、低毒的新型调脂药物具有十分重要的应用前景,也成为了医药学界的研究热点。本实验中的脉抒(Maishu,MS)是一种天然产物组合物,主要原料为山楂、沙棘和枸杞等。IMM-H007是在天然产物虫草素结构基础上进行改造筛选出的具有显著调血脂活性的新型AMPK激动剂,目前处于临床前开发阶段。本实验主要观察这两种受试品对实验性脂代谢紊乱和受累器官损害的保护作用。研究目的本研究主要观察脉抒和IMM-H007对实验性脂代谢紊乱和受累器官的影响。研究方法(1)高脂膳食诱导高脂血症金黄地鼠模型,给予不同剂量脉抒(低剂量:1 g/kg,中剂量:2 g/kg,高剂量:4 g/kg)、辛伐他汀(4 mg/kg)、非诺贝特(54mg/kg),每天灌胃给药一次,观察给药2,4,8周后血清TC,TG,HDL-C,non-HDL-C 的变化;采用快速蛋白液相色谱(fast protein liquid chromatography,FPLC)技术分离给药8周后血清中极低密度脂蛋白(very low density lipoprotein,VLDL)、低密度脂蛋白(low density lipoprotein,LDL)、高密度脂蛋白(high density lipoprotein,HDL),并检测其所携带的-胆固醇含量;采用全自动血液粘度仪检测8周后全血血粘度值;采用离体微血管压力直径灌流系统观察各组金黄地鼠肠系膜小动脉对不同浓度梯度乙酰胆碱(Acetyl choline,Ach)诱导的内皮依赖性舒张反应的变化,评价脉抒对血管内皮功能的影响;测定肝脏TC,TG,计算肝指数;制作肝脏病理切片,进行HE和油红O染色;应用 western blot 方法检测 LDLR,HMGCR,SREBP2,CD36,SCD1 蛋白的表达,探讨脉抒对高脂血症金黄地鼠脂质代谢相关蛋白的影响。(2)采用高脂喂养建立ApoE-/-动脉粥样硬化小鼠模型,观察口服不同剂量脉抒(低剂量:1 g/kg,中剂量:2 g/kg,高剂量:4 g/kg),阿托伐他汀(10 mg/kg),普罗布考(200 mg/kg)10周后ApoE-/-小鼠血脂水平的变化,每天灌胃给药一次;分离主动脉全长,采用油红O染色,观察主动脉全长斑块形成;对主动脉根部冰冻切片分别采用油红O及天狼星红染色,观察主动脉根部斑块形成;采用动态可视化微血管观察系统,观察小鼠体内白细胞-内皮细胞黏附作用;用免疫组化方法检测主动脉根部斑块中巨噬细胞标记物CD68表达变化。(3)高脂膳食诱导高脂血症金黄地鼠模型,给予不同剂量IMM-H007(12.5 mg/kg,25 mg/kg,50 mg/kg,100 mg/kg,200 mg/kg),辛伐他汀(6 mg/kg),非诺贝特(50 mg/kg),每天灌胃给药一次,连续给药8周,在此期间,每周记录动物体重及摄食量。观察给药1,4,8周后血清TC,TG,LDL-C的变化;采用FPLC技术分离给药8周后血清中VLDL,LDL,HDL,并检测其所携带的胆固醇和甘油三酯-含量;测定肝脏TC,TG水平,计算肝指数;制作肝脏石蜡切片做HE染色及冰冻切片油红O染色。实验结果(1)脉抒改善金黄地鼠脂代谢紊乱与正常对照组比,模型组血脂水平明显升高;与模型组比,辛伐他汀(4 mg/kg)仅在给药2周降低血清TC水平;辛伐他汀(4mg/kg)降低血清脂蛋白VLDL,LDL的胆固醇运载量,不影响全血粘度、血管内皮舒张功能、肝脏TC,TG含量及肝指数,但减少肝脏脂质沉积。与模型组比,非诺贝特(54 mg/kg)在给药2周降低血清TC,TG,non-HDL-C水平,给药4周仅降低TG水平,给药8周对血脂无影响;非诺贝特(54 mg/kg)降低血清脂蛋白VLDL、LDL的胆固醇运载量,不影响全血粘度、血管内皮舒张功能,显著降低肝脏TC,TG含量及肝指数和肝脏脂质沉积。与模型组比,脉抒中、高剂量(2 g/kg,4 g/kg)在给药2,4,8周均能明显降低高脂血症金黄地鼠血清TC含量,还可以显著降低血清VLDL,LDL,HDL的胆固醇运载量,并且能够降低高脂血症金黄地鼠肝组织TC,TG的含量,抑制肝指数,改善中切和高切全血粘度;脉抒中剂量(2 g/kg)还可以改善高脂血症金黄地鼠的血管内皮舒张功能;脉抒可能通过抑制肝脏CD36,SCD1蛋白表达,减少脂肪酸摄取和合成来改善高脂膳食引起的肝脏脂肪变性。(2)脉抒抑制ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化形成作用与正常对照组比,模型组血清血脂水平明显升高;与模型组比,阿托伐他汀(10 mg/kg)不影响血脂水平、主动脉根部斑块面积和微循环中白细胞滚动速率,降低主动脉全长斑块与内皮面积占比。天狼星红染色显示阿托伐他汀他汀(10 rng/kg)给药组斑块胶原纤维含量明显较高,CD68免疫组化染色显示主动脉根部斑块中巨噬细胞含量也明显减少。与模型组比,普罗布考(200 mg/kg)降低血清TC水平、主动脉全长斑块与内皮面积占比和主动脉根部斑块面积,不影响微循环中白细胞滚动速率。天狼星红染色显示,普罗布考(200 mg/kg)给药组斑块胶原纤维含量明显较高,CD68免疫组化染色显示,动脉根部斑块中巨噬细胞含量也明显减少。与模型组比,脉抒高剂量(4 g/kg)降低血清TC水平,脉抒低、中、高剂量(1 g/kg,2 g/kg,4 g/kg)显著降低apoE-/-小鼠血清TG水平;主动脉全长斑块形成中,脉抒中、高剂量(2 g/kg,4 g/kg)条件下斑块与内皮面积占比均显著降低;主动脉根部冰冻切片发现,脉抒中、高剂量(2g/kg,4g/kg)给药组主动脉根部斑块面积显著降低;脉抒高剂量(4 g/kg)给药组微循环中白细胞滚动速率显著-增加;天狼星红染色显示,与模型组相比脉抒低、中(1 g/kg,2 g/kg)剂量给药组斑块胶原纤维含量明显较高;CD68免疫组化染色显示,脉抒给药组主动脉根部斑块中巨噬细胞含量也明显减少。(3)虫草素衍生物IMM-H007改善金黄地鼠脂代谢紊乱与正常对照组比,模型组血清血脂水平明显升高;与模型组比,辛伐他汀(6 mg/kg)给药1周时,不影响血脂水平,给药4周时,降低血清TC,TG,LDL-C水平,给药8周时同样降低血清TC,TG,LDL-C水平;辛伐他汀(50 mg/kg)降低脂蛋白VLDL所携带的胆固醇和甘油三酯含量及LDL所携带的甘油三酯含量;辛伐他汀(50 mg/kg)降低肝指数,但未影响脂肪指数和肝脏TC,TG水平,可以改善高脂饮食引起的肝脏组织结构紊乱和脂肪堆积情况。与模型组比,非诺贝特(50 mg/kg)给药组动物体重降低明显,给药1周时,降低血清TC,LDL-C水平,给药4周时,降低血清TC,TG,LDL-C水平,给药8周时同样降低血清TC,TG,LDL-C水平;非诺贝特(50 mg/kg)降低脂蛋白VLDL,LDL所携带的胆固醇和甘油三酯水平;并且降低脂肪指数和肝脏TC,TC含量,增加肝指数,明显改善高脂饮食引起的肝脏组织结构紊乱和脂肪堆积情况。与模型组比,IMM-H007不同剂量给药组,不影响动物体重和摄食;给药1周时,仅IMM-H007(200 mg/kg)降低血清LDL-C水平,给药4周时,IMM-H007(25 mg/kg,200 mg/kg)降低血清 TC,TG,LDL-C 水平,IMM-H007(100 mg/kg)降低血清 TG,LDL-C 水平,给药 8 周时,IMM-H007(100 mg/kg,200 mg/kg)降低血清TC,TG,LDL-C水平;分离出血清脂蛋白后,IMM-H007(200 mg/kg)降低VLDL及LDL的胆固醇和甘油三酯运载量;IMM-H007不同剂量给药组均可以降低肝指数,但对脂肪指数无影响;IMM-H007(100 mg/kg,200mg/kg)降低肝脏TC,TG含量和明显改善高脂饮食引起的肝脏组织结构紊乱和脂肪堆积情况。结论(1)脉抒具有改善高脂膳食诱导的金黄地鼠血脂代谢紊乱和肝脏脂肪沉积的作用,可能是通过抑制肝脏CD36,SCD1蛋白表达减少脂质沉积。(2)脉抒有效抑制apoE-/-小鼠动脉粥样硬化模型主动脉斑块形成,可能与其减少斑块内巨噬细胞数量有关。(3)IMM-H007具有改善高脂膳食诱导的金黄地鼠血脂代谢紊乱和肝脏脂肪沉积的作用。
【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R285.5
【图文】：

金黄地鼠,高脂血症,相关蛋白

与模型组比较，脉抒高、中剂量组（４邋ｇ／ｋｇ，邋２邋ｇ／ｋｇ）对高脂膳食引起的高脂逡逑血症金黄地鼠肝脏ＨＭＧＣＲ，邋ＬＤＬＲ，邋ＳＲＥＢＰ２蛋白表达并没有统计学上的差异。逡逑见图７。逡逑Ａ逦ＭＳ邋ＭＳ逦Ｂ逦１．０－ｊ逦□邋Ｃｏｎｔｒｏｌ逡逑Ｃｏｎｔｒｏｌ邋Ｍｏｄｅｌ邋ＮＩｉ（］（１｜ｅ邋，Ｉｊｇ｜）逦．逦ｔ逦■邋Ｍｏｄｔｌ逡逑Ｉ逦逦逦｜逦ｆ０８＇逦Ｃ３邋ＭＳ邋Ｍｉｄｄｌｅ逡逑瞧ｆｆ邋ｒｆｔｒ叫逡逑＾０４邋｜邋Ｉ邋Ｉ邋Ｉ邋｜邋Ｉ逡逑：：：ｃ邋＾ＪｌｌｌＵｌＵ逡逑图７．脉抒不影响高脂血症金黄地鼠肝脏胆固醇代谢相关蛋白ＳＲＥＢＰ２，邋ＬＤＬＲ，逡逑ＨＭＧＣＲ的表达。Ａ为具有代表性的一次实验结果；Ｂ为Ｗｅｓｔｅｒｎ邋Ｂｌｏｔ蛋白条带逡逑信号密度值，每组取５个样品混合后上样，平均值±标准误（ｎ＝５）。逡逑３７逡逑

金黄地鼠,高脂血症,相关蛋白,肝脏

高（Ｐ＜邋０．０５，尸＜０．０５）；与模型组比，脉抒高、中剂量组金黄地鼠肝脏ＣＤ３６逡逑蛋白表达量降低（尸＜０．０５，Ｐ＜０．０５），另外，脉抒高、中剂量组（４ｇ／ｋｇ，２ｇ／ｋｇ）逡逑金黄地鼠肝脏ＳＣＤ１蛋白表达量也降低（尸＜０．０５，尸＜０．０５）。见图８。逡逑Ａ逦Ｂ邋ｉ．ｏｎ逦终逡逑ｔＣＺｌ邋Ｃｏｎｔｒｏｌ逡逑■邋Ｍｏｄｅｌ逡逑您邋ＭＳ邋Ｍｉｄｄｌｅ逡逑ｒ逡逑ＣＤ３６／Ａｃｔｉｎ逦ＳＣＤ１／Ａｃｔｉｎ逡逑图８．脉抒降低高脂血症金黄地鼠肝脏脂肪酸代谢相关蛋白ＣＤ３６，邋ＳＣＤｌ的表达逡逑（ｎ＝５）。Ａ为具有代表性的一次实验结果；Ｂ为Ｗｅｓｔｅｒｎ邋Ｂｌｏｔ蛋白条带信号密逡逑度值，每组取５个样品混合后上样，平均值±标准误（ｒｉ＝５）。逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋８．邋Ｍａｉｓｈｕ邋ｒｅｄｕｃｅｓ邋ｐｒｏｔｅｉｎ邋ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋ｏｆ邋ｆａｔｔｙ邋ａｃｉｄｓ邋ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ－ｒｅｌａｔｅｄ邋ＣＤ３６逡逑ａｎｄ邋ＳＣＤｌ邋ｉｎ邋ｔｈｅ邋ｌｉｖｅｒｓ邋ｏｆ邋ｈｙｐｅｒｌｉｐｉｄｅｍｉｃ邋ｇｏｌｄｅｎ邋ｈａｍｓｔｅｒｓ．邋Ａ）邋Ｗｅｓｔｅｒｎ邋Ｂｌｏｔｓ邋ａｎｄ逡逑ｄｅｎｓｉｔｏｍｅｔｒｙ邋ｏｆ邋ＣＤ３６邋ａｎｄ邋ＳＣＤｌ．邋Ｂ）邋Ｄａｔａ邋ａｒｅ邋ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ邋ａｓ邋ｍｅａｎ±邋ＳＥＭ邋（ｎ＝５）．逡逑＃＾＜０．０５

【参考文献】