黄柏碱抗ROS介导的氧化应激相关机制研究

发布时间：2020-07-11 17:58

【摘要】：目的:黄柏是一种常用中药,在我国分布广泛、资源丰富,在《中国药典》中黄柏的活性成分检测包括小檗碱和黄柏碱,但是在工业生产上黄柏常常作为提取小檗碱的主要原料,而含有黄柏碱的工业废水排放到环境中造成了大量的浪费和污染。本课题主要是模拟工业生产对黄柏提取小檗碱后的废液进行黄柏碱的回收提取工艺研究,并且对黄柏碱进行了系统的抗氧化活性及其相关机制研究,其意义在于加强黄柏资源的合理利用以及环境保护作用,同时为黄柏碱的临床开发应用提供理论依据。方法和结果:(1)本研究采用工业上常用的大孔树脂进行黄柏碱进行富集,然后采用反相硅胶柱层析进行分离纯化,整个过程使用TLC鉴别和HPLC进行含量和纯度的分析。结果显示,流出液的体积在5.5BV时黄柏碱开始出现渗漏,因此最大上样量为5BV;黄柏碱通过大孔树脂富集回收后的纯度约为70%,回收率为71.76%;反相硅胶柱层析采用甲醇-水梯度洗脱,用60%的甲醇加少量浓氨水能够迅速将大部分黄柏碱洗脱下来,减压浓缩后加一定量的甲醇置4℃冰箱中结晶,经HPLC分析纯化后的黄柏碱纯度可达到90%,将此结晶加少量浓盐酸溶解后再加适量甲醇进行重结晶可得纯度为98%以上的黄柏碱单体,最后的整体回收率约35.59%。(2)黄柏碱进行体外抗氧化活性分析主要采用了化学分析法以及荧光分光光度法。在体外实验中发现黄柏碱有较好的清除ABTS+、DPPH自由基、O2.-的作用,并且在相同浓度下黄柏碱清除DPPH的能力比小檗碱强;本实验还利用A549细胞模型评价了黄柏碱清除ROS的能力,结果显示黄柏碱的浓度为5、25μg/ml时在细胞中有显著的清除ROS的作用。(3)以斑马鱼胚胎为模型对黄柏碱进行体内抗氧化活性分析,主要采用DCFH-DA、DPPP、AO荧光染料处理后再用荧光显微镜拍照并分析荧光强度。结果显示不同浓度的黄柏碱对由AAPH引起的斑马鱼胚胎死亡以及心跳异常等现象均有较好的保护效果,特别是200μg/ml的黄柏碱能够在72h时将斑马鱼胚胎的存活率提高到90.26±1.40%;此外,黄柏碱在斑马鱼体内还具有较好的清除ROS,降低脂质过氧化以及细胞死亡率的效果,特别是在清除ROS方面呈现剂量依赖关系。(4)分别以斑马鱼胚胎和A549细胞为模型对黄柏碱的抗氧化机制进行研究,主要使用了RT-PCR以及蛋白免疫印迹法分别对抗氧化通路上的关键基因和蛋白进行了检测。结果显示,在斑马鱼体内100μg/ml的黄柏碱能够显著提高AKT、Nrf2、HO-1和Bcl-2基因的表达而对NF-κB和P53基因具有下调的作用;通过WB分析发现黄柏碱能够抑制AKT以及NF-κB的磷酸化作用,加入通路抑制剂LY294002和BAY11-7082后能够显著抑制AKT和NF-κB对应的下游蛋白的表达,而黄柏碱与此有相同的作用。结论:在对黄柏碱的回收提取过程中主要采用了医药工业上常用的大孔树脂和C18硅胶填料,在洗脱剂方面主要使用的是乙醇、甲醇和水,它们廉价易得且回收方便对环境污染少。此外研究显示黄柏碱在体内外均具有较好的抗氧化作用,体外抗氧化活性评价发现黄柏碱清除DPPH自由基的效果比小檗碱强。机制研究发现黄柏碱在斑马鱼胚胎体内主要是激发了AKT/Nrf2/HO-1这一关键性的抗氧化防御系统,从而达到清除ROS的作用,提高了胚胎的存活率。由于NF-κB不仅与氧化应激相关而且还是炎症反应的重要通路,因此在A549细胞中对这一通路进行了深入研究,结果发现黄柏碱能够抑制ROS引起的炎症通路上相关蛋白的表达主要是通过抑制IKK/NF-κB通路来实现的,同时它还能够显著降低NF-κB的下游蛋白COX-2的表达。
【学位授予单位】：西南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R285

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