梅花鹿茸、鹿血中主要病原微生物及兽用麻醉药残留检测技术的研究

发布时间：2020-07-12 10:53

【摘要】：梅花鹿茸是我国传统的名贵中药,而鹿血中又含有多种生物活性物质,二者早在几千年前就已作为药用或者保健滋补佳品。污染物的存在会直接影响梅花鹿茸及鹿血相关产品质量,给使用安全带来巨大隐患,因此研究优化梅花鹿茸及鹿血中污染物残留的检测方法十分重要。本文以梅花鹿主要人畜共患病病原微生物布鲁氏菌和结核分枝杆菌为检测对象,建立了梅花鹿茸及鹿血的布鲁氏菌和结核分枝杆菌实时荧光定量PCR检测方法。同时,针对于化学保定取茸技术导致麻醉药残留的现状,建立了两种兽用麻醉药赛拉嗪和二甲苯胺噻嗪的超高液相-三重四级杆质谱联用和三重四级杆气质联用检测方法。本论文研究内容主要分为四部分:(1)根据已报道的布鲁氏菌特异性基因序列IS711,设计并送生物公司合成引物和荧光探针,以成功制备的标准品为模板,建立布鲁氏菌实时荧光定量PCR检测体系,并对该方法的重复性、特异性和敏感性进行评价。实验结果表明,以布鲁氏菌IS711标准阳性质粒为模板重复做四组,于相同的条件下完成反应,Ct值分别为15.13、16.58、16.17、17.09,说明该方法重复性良好。以猪布鲁氏菌S2(B.suis S2)、牛布鲁氏菌S19(B.abortus S19)、羊布鲁氏菌M5(B.melitensis M5)、结核分枝杆菌H37Rv(Mycobacterium tuberculosis H37Rv)、牛病毒性腹泻病毒NADL(Bovine viral diarrhea virus NADL,BVDV NADL)为模板,对该体系的特异性进行考察。结果显示,结核分枝杆菌H37Rv、BVDV NADL为模板均没有明显的扩增曲线,可判定为阴性,说明该体系特异性良好。所绘制的标准曲线相关系数R~2值为0.996,呈良好的线性相关关系。将已知浓度的阳性标品梯度稀释,最小检测拷贝数为4 Copies/uL,说明该方法具有良好的敏感性。应用所建立的方法,对目的性采集的鹿场中有布鲁氏菌病患病相似症状,疑似阳性鹿血及鲜鹿茸样品进行方法的对比验证,其中30份PPD鹿血阳性样品中,15份呈阳性,2份疑似阳性;30份PPD鲜鹿茸阳性样品中,15份呈阳性,成功构建了简单快速、灵敏性高、特异性强的检测方法。(2)根据结核分枝杆菌基因序列Rv3873,设计合成特异性引物和探针,并通过单因素考察试验,优化该体系反应条件,以成功制备的标准品为模板,建立了结核分枝杆菌实时荧光定量PCR检测方法。实验结果表明,以构建好的标准质粒为模板重复做四组,Ct值分别为19.22、19.23、19.11、18.26,说明该方法重复性良好。结核分枝杆菌H37Rv、牛结核分枝杆菌(M.bovis)、猪布鲁氏杆菌S2、牛布鲁氏菌S19、牛病毒性腹泻病毒NADL为模板,进行特异性检测。结果显示,猪布鲁氏杆菌S2、牛布鲁氏菌S19、牛病毒性腹泻病毒NADL为模板均没有明显的扩增曲线,说明该体系特异性良好。所获得的动力学曲线相关系数R~2值为0.999,呈良好的线性相关关系。将标准样品的原始浓度进行10倍倍比稀释,最小检测拷贝数为4 Copies/uL,说明该方法具有良好的敏感性。应用建立的实时荧光定量PCR方法对模拟感染样品进行验证,结果显示,阳性组织样品100%被检出,阳性鹿血样品检出率83.33%,所建立方法的检测准确率高于普通PCR检测方法。(3)建立了超高液相-三重四级杆质谱联用技术检测梅花鹿茸、鹿血中兽用麻醉药赛拉嗪残留的方法,分别对样品的前处理技术、提取条件、色谱条件等进行优化,并对该方法的精密度和准确度进行评价。结果显示,赛拉嗪在鹿茸和鹿血中的检出限为0.1 ng/mL~0.5 ng/mL,定量下限为0.2 ng/mL~1.0 ng/mL且R~2值为0.9968,成功构建标准曲线。结果表明,所建立的方法重现性好、快速准确,适用于梅花鹿茸及鹿血相关产品中的兽用麻醉药残留检测。(4)建立了三重四级杆气质联用技术检测梅花鹿茸、鹿血中兽用麻醉药二甲苯胺噻嗪残留的方法,通过优化样品处理条件及对色谱柱的选择,能够对采集的样品进行准确定量,并考察该方法的适用性。结果显示,二甲苯胺噻嗪在鹿茸和鹿血中的检出限为20ng/mL,定量下限为50 ng/mL。计算得到线性方程为Y=8966X-451812,R~2值为0.9919,成功构建标准曲线。结果表明,所建立的方法准确高效,为中药梅花鹿茸质量安全评价提供技术支持。本研究建立了梅花鹿茸、鹿血中两种主要病原微生物布鲁氏菌和结核分枝杆菌的实时荧光定量PCR检测方法及两种兽用麻醉药的超高液相-三重四级杆质谱联用和三重四级杆气质联用检测技术。所建立的鹿茸及鹿血的污染物检测方法,具有样品前处理简单、分析特异性强且灵敏度高的特点。为梅花鹿茸、鹿血产品中主要病原微生物及兽用麻醉药的残留检测供了重要技术支持,对于鹿茸及鹿血相关产品的食品安全评估体系的完善和补充有着重要意义。
【学位授予单位】：吉林农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R284
【图文】：

全基因组,基因组

图 2.1 S2 的全基因组.2.1 Complete genome oDL15000 1：基因组 L15000 1：Genomic进行 PCR 扩增，获M 1 2pp

基因组

图 2.1 S2 的全基因.2.1 Complete genome DL15000 1：基因组DL15000 1：Genomi果，进行 PCR 扩增，00bp00bp0bp0bp0bp0bpbpM 1 2

扩增曲线,样品,反应体系,重组质粒

图 2.3 IS711 重组质粒 PCR 扩增结果Fig.2.3 Recombinant plasmid PCR resultsM：DL2000 1：重组质粒 2：阴性对照M：DL2000 1：Recombinant plasmid 2：Negative control光定量 PCR 反应体系建立规反应体系及条件对 5 个不同初始浓度的标准质粒样品进行反 Ct≤30，可判定为阳性，见图 2.4。2000bp1000bp750bp500bp250bp100bp

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