包载葛根素抗cTnI抗体修饰的脂质体心肌靶向性研究

发布时间：2020-07-14 18:02

【摘要】：心肌缺血性疾病给人们的生命安全和生活质量带来很大的危害。长期心肌缺血得不到改善会带来永久性心脏损伤。西医对心肌缺血疾病的治疗主要依靠药物干预和外科手术的方法,而外科手术对患者的创伤较大,存在较高的风险性。中药凭借其性质温和及毒副作用低的优势,越来越受到广大患者的青睐。葛根素对治疗心肌缺血具有显著的作用,但是由于葛根素水不溶性从而导致口服葛根素的生物利用率低,限制了葛根素在治疗心肌缺血方面的应用。因此,通过对脂质体进行修饰,利用靶向递送方式直接将葛根素富集在心肌缺血的细胞中,可以较大程度的提升葛根素的生物利用度。本研究利用薄膜分散法经超声水化处理制得空白脂质体(LIP)和葛根素脂质体(Pue-LIP)。通过4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)分别处理DSPE-PEG2000-MAL和抗cTnI抗体,经过12h的孵育得到Anti-cTnI Ab-PEG2000-DSPE连接物后和空白脂质体孵育得到抗心肌肌钙蛋白修饰的脂质体(Anti-cTnI Ab-LIP),再通过将Anti-cTnI Ab-PEG2000-DSPE与所制备的葛根素脂质体进行孵育得到抗cTnI抗体修饰的葛根素脂质体(Anti-cTnI Ab-Pue-LIP)。通过透射电镜(TEM)观察所制备的脂质体形态、采用激光粒度仪检测脂质体的粒径和Zeta电位,并计算包封率、载药量及药物释放。MTT法评价脂质体毒性。MST评价LIP和Anti-cTnI Ab-LIP与cTnI抗原的相互作用情况,以此评价抗体与抗原靶向结合能力。流式细胞仪和活细胞工作站检测心肌细胞对抗体修饰的脂质体的摄取情况。小动物活体成像技术检测脂质体在大鼠心脏部位的摄取强度。采取构建大鼠心肌缺血模型的方法,用TTC染色大鼠心脏评判大鼠心肌缺血模型是否成功建立。通过大鼠心电图的分析和小动物超声成像技术对Anti-cTnI Ab-Pue-LIP的药物效果进行评价。电镜观察所制备的脂质体(Anti-cTnI Ab-Pue-LIP)为规则的圆球形。激光粒度仪检测结果表明,Anti-cTnI Ab-Pue-LIP粒径均匀分布且平均粒径均在100-120 nm之间,脂质体带负电,电荷量在-33.4±0.79 mV左右。Anti-cTnI Ab-Pue-LIP包封率为72.7±1.47%,载药量为 2.12±0.21%。在 8h 时测得的 Anti-cTnI Ab-LIP、Anti-cTnI Ab-Pue-LIP的释放度分别为47.72±2.37%和46.79±2.46%。小动物活体成像实验结果表明Anti-cTnI Ab-LIP体内荧光强度最强。MTT实验结果显示将药物用脂质体包载后能有效的降低药物对细胞的毒性。流式细胞仪检测结果表明心肌细胞对Anti-cTnI Ab-LIP摄取能力为普通脂质体的3.6倍。活细胞工作站结果显示Anti-cTnI Ab-LIP能成功富集在心肌细胞。MST检验结果表明Anti-cTnI Ab-LIP与心肌缺血标记物心肌肌钙蛋白(cTnI)的结合能力更强,Kd值为116.3±46.35nM。小动物超声成像显示Anti-cTnI Ab-Pue-LIP能有效缓解由心肌缺血引起的左室末期容积增大现象;大鼠心电图结果显示Anti-cTnI Ab-Pue-LIP能改善心肌缺血大鼠的心电波动,使其趋向于正常大鼠的心电图。以上结果表明采用薄膜分散法并用超声处理制得脂质体体系稳定、粒径较小、分散均匀且包封率理想。经过抗cTnI抗体修饰的葛根素脂质体对药物的释放没有明显影响。Pue-LIP和Anti-cTnI Ab-Pue-LIP对细胞的毒性更小。Anti-cTnI Ab-LIP的靶向性更优良能成功富集于缺血心肌细胞中。Anti-cTnI Ab-Pue-LIP对心肌缺血的具有良好的治疗效果。因此抗cTnI抗体修饰的葛根素脂质体是对心肌缺血性疾病有良好治疗效果的靶向给药系统。
【学位授予单位】：哈尔滨商业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R283.6
【图文】：

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哈尔滨商业大学硕士学位论文进展及成果逡逑栛逡逑植物，生长在阴湿的环境中，须根多，块根深生，呈纺色长硬毛，发达的侧根向四周伸展，相互缠绕成根网状。绒毛，呈菱片卵圆形或阔卵圆形状。花呈蝶形紫红色，黄色粗硬长毛。其根、藤茎、叶、花和种子均可入药。其葛根黄酮含量丰富，所以葛根的药用价值很高。葛根要成分，此外，葛根中还含有为数不多的黄酮衍生物、素等。葛根素是植物葛根的主要有效成分。逡逑

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图１－２脂质体修饰载药示意图逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１－２邋Ｓｃｈｅｍａｔｉｃ邋ｄｉａｇｒａｍ邋ｏｆ邋ｌｉｐｏｓｏｍｅ逡逑１邋＿３＿２脂质体实现心肌勒向性的作用机理逡逑脂质体（ｌｉｐｏｓｏｍｅ）是一种人工合成的类细胞膜结构，其基本构造和理化性质与细胞膜的结构逡逑相似，所以脂质体又称为人工生物膜。逡逑有相关科学实验得出结论，粒径范围在２００ｎｍ以上的脂质体很容易被血清调理素吸附，从而逡逑被吞噬性细胞吞噬；脂质体粒径范围在５０ｎｍ－１００ｎｍ之间的脂质体则可以避免被网状内皮系统所吞逡逑噬。根据机体对不同粒径的脂质体的吸收程度不同的特点，就为脂质体靶向心肌细胞提供了理论基逡逑础。依据相关研究，脂质体粒径范围在１０ｎｍ－１５０ｎｍ之间的可以在心肌细胞组织集聚，脂质体粒径逡逑在ｌｌＯｎｍ左右的最容易在心肌细胞组织停留并蓄积。脂质体吞噬也会受到脂质体表面电荷量的影逡逑响，与带中性电荷的脂质体对比，带正电的脂质体与负电的脂质体与吞噬性细胞结合更加容易，从逡逑而能起到降低药物在血液中的半衰期的作用。逡逑由于各方面的原因我国居民受到心脑血管疾病的困扰，由于心脑血管疾病的组织特异性很低所逡逑以治疗的过程给人们带来了极大的痛苦。患者需要加大药物剂量和浓度来达到治疗的目的，这就必逡逑

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、据对所制备的脂质体进行评价。并对抗ｃＴｎｌ抗体修饰的葛根素脂质体进行了稳定性检测以及长逡逑稳定性检测。测量了抗ｃＴｎｌ抗体修饰的葛根素脂质体的包封率和载药量，并且对葛根素脂质体逡逑抗ｃＴｎｌ抗体修饰的葛根素脂质体进行了药物释放方面的对比和评价。逡逑（３）细胞水平对所制备的脂质体进行研宄：重点对葛根素脂质体和抗ｃＴｎｌ抗体修饰的葛根素逡逑质体进行了细胞毒性的检测，评价相关脂质体的安全性。通过ＭＳＴ检验所制备的脂质体与ｃＴｎｌ逡逑原亲和能力评价所制备脂质体的靶向效果。通过流式细胞术和活细胞工作站检测评价心肌细胞对逡逑制备的脂质体的摄取情况。逡逑（４）动物水平对所制备的脂质体进行研究：通过对脂质体和抗ｃＴｎｌ抗体修饰的脂质体进行荧逡逑标记，通过建立大鼠心肌缺血模型并注射经过荧光标记的脂质体通小动物活体成像技术，考察脂质体在大鼠体内的分布以及荧光强度对脂质体的靶向性进行评价。逡逑（５）相关载药脂质体药效评价：通过构建大鼠心肌缺血模型并对所建立的模型进行检验，生物机能实验系统对给药大鼠心电图的前后变化、利用小动物超声仪检测心肌缺血大鼠给药前后逡逑变化来评价所制备的靶向脂质体的药物疗效。逡逑—Ｎｏｉｒｎａｉ逦￣￣、ＬｅｓｉｏｎＭｏｃａｒｄｉａｌ邋ｒｅｌｅａｓｅＣａｒｄｉａｃ邋ｔｒｏｏｎｉｎ邋１１逡逑

【参考文献】