断藤益母汤对类风湿性关节炎破骨细胞分化及功能的影响和可能机制探讨

发布时间：2020-07-15 04:57

【摘要】：目的:本研究在前期工作的基础上,拟通过观察断藤益母汤对RAW264.7巨噬细胞诱导的破骨细胞分化、增殖及功能的影响,揭示断藤益母汤抑制破骨细胞分化及其功能的分子机制,从而为临床上应用断藤益母汤治疗类风湿关节炎提供实验依据,并有助于进一步推广断藤益母汤的应用,让更多的病人获益。方法:实验一:建立RAW264.7巨噬细胞诱生破骨样细胞模型,设立空白组,模型组,DTYMT400mg·L~(-1)、600mg·L~(-1)、800mg·L~(-1)、1000mg·L~(-1)浓度组和甲氨蝶呤2mg·L~(-1)组,制备断藤益母汤冻干粉,并对各组进行相应干预。实验二:通过TRAP染色对破骨细胞进行鉴定,探讨断藤益母汤对破骨细胞分化的影响。实验三:通过CCK-8法检测各组细胞生存率,探讨断藤益母汤对破骨细胞增殖的影响。实验四:通过蛋白免疫印迹法检测Wnt和RANKL信号通路关键蛋白表达,探讨断藤益母汤对破骨细胞的分子通路作用机制。实验五:通过ELISA检测MMP-9炎症因子水平,探讨断藤益母汤对炎症因子的影响。结果:实验一、二TRAP染色试验显示,与模型组相比,DTYMT400mg·L-1、600mg·L-1浓度组的融合细胞数量有所减少,但差异无统计学差异(P0.05);DTYMT800mg·L-1、1000mg·L-1浓度组融合细胞数目显著减少,具有统计学意义(P0.01),提示当断藤益母汤浓度达到一定水平后,可以有效抑制OC的分化。实验三CCK8结果显示,与模型组比较,DTYMT600mg·L-1、800mg·L-1、1000mg·L-1浓度组和甲氨蝶呤2mg·L-1组生存率明显下降(P0.05,P0.01),提示一定浓度的断藤益母汤可以明显抑制OC的增殖。实验四免疫印迹结果显示,与模型组相比,DTYMT1000mg·L-1组、甲氨蝶呤2mg·L-1组中RANKL蛋白表达量有所下降(P0.05)。DTYMT各组中的OPG蛋白表达水平无明显上升或下降(P0.05);DTYMT800ug/ml、1000ug/ml浓度组、甲氨蝶呤2ug/ml组中Wnt3a、β-catenin蛋白表达量显著上升,DKK1蛋白表达水平显著下降,提示一定浓度的DTYMT可以有效降低RANKL表达水平,增加Wnt3a、β-catenin蛋白表达和下调DKK1表达。实验五ELISA结果显示,与模型组相比,DTYMD600mg·L-1、800mg·L-1、1000mg·L-1浓度组及甲氨蝶呤组中的MMP-9表达水平均有所下降,且DTYMT浓度越高,下降越明显,提示DTYMT能显著降低MMP-9的表达水平。结论:1.当断藤益母汤药物浓度达到800ug/ml、1000ug/ml时,可以有效抑制OC的分化。2.当断藤益母汤药物浓度达到600ug/ml、800ug/ml、1000ug/ml时,对破骨细胞的增殖具有抑制效果,且药物浓度越高,抑制效果越明显。3.当断藤益母汤药物浓度达到800ug/ml、1000ug/ml时,可以增加Wnt3a、β-catenin蛋白表达和下调DKK1表达。当断藤益母汤药物浓度达到1000mg·L-1时,可以有效降低RANKL表达水平。断藤益母汤各浓度组对OPG蛋白的表达无明显影响。4.断藤益母汤药物浓度达到600mg·L-1、800mg·L-1、1000mg·L-1时,能显著降低MMP-9的表达水平。
【学位授予单位】：广州中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R285
【图文】：

视野,药物浓度,生存率,统计学意义

24注：***P<0.01图2 每视野下平均阳性细胞数。Figure 2. Average number of positive cells per field of view.4.3.2 断藤益母汤对破骨细胞生存率的影响通过一般线性模型重复测量方差分析，得出组内效应检验结果 F=5.11,P=0.015>0.05，说明各组经过不同的亚欧网浓度和干预时间之后，生存率存在差别，且具有统计学意义。同时药物浓度与干预时间存在交互效应。组间检验效应结果显示F=53.26，P=8.9063E-8<0.05，说明不同的药物浓度组之间，生存率具有差异，且具有统计学意义。由图 3 可知，模型组比较，DTYMT400mg L-1 组细胞生存率无明显降低，；DTYMT600mg L-1、800mg L-1、1000mg L-1 浓度组和甲氨蝶呤 2mg L-1 组生存率均具有明显下降，且与药物浓度及干预时间相关，药物浓度越高，干预时间越久，下降越明显。

破骨细胞,生存率

图3.DTYMT对破骨细胞生存率影响Figure 3. Effect of DTMT on osteoclast survival4.3.3 断藤益母汤对 Wnt 通路和 RANKL 通路关键蛋白表达的影响给药干预细胞 24h 后，Wnt 通路和 RANKL 通路相关蛋白的表达条带，如图 17。对带灰度行半定量分析，每个蛋白的数据单独采用单因素方差分析方法检验，得出各

条带,甲氨蝶呤,组图,蛋白表达

A.空白组；B.模型组；C.600mg L-1 组；D.800mg L-1 组；E.1000mg L-1 组；F.甲氨蝶呤 2mg组图 4 Wnt 通路和 RANKL 通路相关蛋白的 WB 表达条带Figure 4. WB expression of Wnt pathway and RANKL pathway-associated prote表 3 DTYMT 对 Wnt 通路和 RANKL 通路关键蛋白表达的影响(x±s，n=3)

【参考文献】