淫羊藿次苷Ⅱ对大鼠皮层神经元低氧性轴突损伤的保护作用及其机制的初步研究

发布时间：2020-07-16 16:01

【摘要】：目的:探讨淫羊藿次苷Ⅱ(icarisidⅡ,ICSⅡ)对大鼠皮层神经元低氧性轴突损伤的保护作用及其机制,为临床低氧性轴突损伤的治疗提供实验依据。方法:原代培养的新生SD大鼠皮层神经元。为探索氧浓度和缺氧时间对神经元轴突损伤的影响,将神经元随机分为正常组、5%低氧组、10%低氧组、15%低氧组。为探究ICSⅡ对低氧性轴突损伤的保护作用及机制,将神经元随机分为正常组、10%低氧组、10%低氧+ICSⅡ3μM组、10%低氧+ICSⅡ6μM组、10%低氧+ICSⅡ9μM组、10%低氧+PI3K抑制剂组、10%低氧+ICSⅡ9μM+PI3K抑制剂组。于5%CO_2、37℃环境下进行神经元培养,正常组为自然环境氧浓度,各低氧组使用N_2调节氧浓度,无菌密闭低氧箱中持续培养。除LY294002作用48h外,其余各组均分别培养24h、48h和72h。各PI3K抑制剂组均先予以PI3K抑制剂LY294002 20μM预处理1h后加入维持培养基或ICSⅡ。分别在各观察时间点进行相应指标测定:噻唑蓝(MTT)法测定神经元细胞活力,微量酶标法检测培养液上清中乳酸脱氢酶(LDH)活力,β-ⅢTubulin免疫荧光染色观察轴突网络形态学变化,并测量轴突变性指数(DI)及最长突起长度进行量化分析。结果:(1)与正常组比较,低氧条件下培养的SD大鼠皮层神经元折光性下降,胞体肿胀,轴突网络逐渐崩解,轴突断裂、缩短甚至消失。随着氧浓度的降低,轴突损伤逐渐加重。与正常组比较,15%氧浓度时轴突网络部分崩解,串珠形成,轴突断裂、缩短,细胞存活率及培养上清液中LDH活力无显著性改变(P0.05,P0.05);10%氧浓度时,24h、48h其轴突缩短明显而神经元存活率无明显变化(P0.05,P0.05);72h其轴突网络崩解,细胞存活率下降且培养上清液中LDH活力升高(P0.05,P0.05);5%氧浓度时轴突网络完全崩解、甚至消失,细胞存活率下降且培养液上清中LDH活力升高(P0.05,P0.05)。(2)在10%氧浓度培养72h,与10%低氧组比较,ICSⅡ(3μM)组未见明显的保护作用,中高ICSⅡ(6μM、9μM)组轴突明显延长,细胞存活率上升,但仍低于正常组。PI3K抑制剂预处理后,与10%低氧组比较,ICSⅡ各组轴突无明显改变(P0.05)。结论:(1)低氧状态下,体外培养SD大鼠皮层神经元发生轴突损伤,随着缺氧时间延长及缺氧程度加重,逐渐出现胞体损伤,表明低氧条件下的轴突损伤早于细胞损伤。(2)在10%低氧条件ICSⅡ对轴突损伤有保护作用,这可能是通过激活PI3K信号通路发挥作用。
【学位授予单位】：遵义医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R285.5
【图文】：

荧光显微镜,分析软件,神经元,轨迹

图 1 突起长度的测定方法 A: 神经元倒置荧光显微镜拍照；B: 分析软件手动描绘出突起的轨迹，测量最长突起的长度。1.4 统计学方法采用 SPSS23.0 软件进行统计学分析，结果以x ±s 表示。多组间均数差异比较

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图 2 新生 SD 大鼠皮层神经元 6 天（×200）图 3 新生 SD 大鼠皮层神经元 7 天（×200）.1.2 皮层神经元纯度的鉴定通过免疫荧光染色进行，如（图 4）所示：神经细胞的胞体和突起能被 β-ⅢTub标记呈绿色；而所有细胞的细胞核可被 DAPI 标记而呈蓝色。通过计算 β-ⅢTub

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细胞长势和密度达到最佳状态（见图 2、图3）。图 2 新生 SD 大鼠皮层神经元 6 天（×200）图 3 新生 SD 大鼠皮层神经元 7 天（×200）2.1.2 皮层神经元纯度的鉴定通过免疫荧光染色进行，如（图 4）所示：神经细胞的胞体和突起能被 β-ⅢTubulin所标记呈绿色；而所有细胞的细胞核可被 DAPI 标记而呈蓝色。通过计算 β-ⅢTubulin所标记细胞与所有细胞的比值，即得出该体系培养神经元细胞的纯度。通过计算得出本培养体系得出的神经元细胞纯度在 90%左右。β-Ⅲ Tubulin DAPI Merged图 4 SD 大鼠乳鼠原代皮层神经元鉴定（×400，比例尺：20μm）

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