臭椿苦酮抑制人早幼粒白血病HL-60细胞株增殖及其机制
发布时间：2020-07-18 00:44
【摘要】：目的:臭椿苦酮是从传统中国药用植物臭椿中提取的苦木素类天然小分子化合物,臭椿苦酮已被证实具有抗肿瘤、抗艾滋、抗疟疾、抗过敏、消炎等多种活性。但是臭椿苦酮对人早幼粒白血病HL-60细胞株的抗增殖作用及其潜在机制尚未见报道。在本研究中,我们通过细胞分子生物学手段进行实验,目的是讨论臭椿苦酮在体外对HL-60细胞株的增殖抑制作用及其机制。方法:在体外通过MTT实验检测臭椿苦酮对HL-60细胞株生存活力的影响。通过Annexin V-APC/7-ADD染色细胞,运用流式细胞仪测定细胞凋亡比例。通过碘化丙啶(PI)染色细胞,运用流式细胞仪分析细胞周期变化。通过吖啶橙(AO)染色,在电子显微镜下观察臭椿苦酮能否诱导HL-60细胞出现自噬现象。通过蛋白印迹实验(WB)检测自噬相关蛋白的表达水平。通过添加自噬抑制剂,讨论臭椿苦酮诱导的自噬现象在其抑制HL-60细胞增殖过程中扮演的角色。结果:MTT实验显示臭椿苦酮对HL-60细胞具有很强的细胞毒性,并且对细胞的增殖抑制作用呈现浓度-时间依赖性,24、48、72小时半数抑制浓度(IC50)分别为12.18、8.497、5.986μmol/L。Annexin V-APC/7-ADD染色试验显示臭椿苦酮可诱导HL-60细胞发生凋亡,并且凋亡细胞数量呈浓度依赖性,5、10、20μmol/L臭椿苦酮作用48小时后,各组细胞凋亡率分别为42.02±0.54,52.05±2.27,59.69±0.25%;PI染色显示臭椿苦酮可通过上调G0/G1期细胞的百分比使HL-60细胞发生细胞周期阻滞,各组G0/G1期细胞比例分别为53.54±0.88,58.42±0.31和65.57±3.16%。AO染色提示臭椿苦酮可诱导HL-60细胞的细胞质中酸性自噬囊泡的形成,提示臭椿苦酮可诱导HL-60细胞发生自噬,运用BaF-A1预处理可以显著减弱这个过程。WB实验显示臭椿苦酮以剂量依赖的方式上调了HL-60细胞中beclin-1和LC3-II蛋白并下调了LC3-I和p62蛋白的表达水平。通过MTT实验进行细胞活力测定和Annexin V-APC/7-ADD染色进行细胞凋亡测定,运用BaF-A1预处理的方式进行对比,发现臭椿苦酮对HL-60细胞的抗增殖作用可能部分归因于诱导自噬介导的细胞凋亡。结论:臭椿苦酮对人早幼粒白血病HL-60细胞具有很强的细胞毒性,可能与其能诱导HL-60细胞凋亡、周期阻滞和自噬有关。臭椿苦酮可能通过促进自噬核心蛋白beclin-1的表达,抑制p62蛋白表达,并且促进LC3-I蛋白向LC3-II蛋白转化来诱导HL-60细胞发生自噬性细胞凋亡。
【学位授予单位】：皖南医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R285
【图文】：
结 果1 臭椿苦酮抑制HL-60细胞增殖1.1 臭椿苦酮结构式（图1.A）。1.2 MTT 实验用于评估臭椿苦酮的细胞毒性对 HL-60 细胞株增殖的影响；实验结果表明，在体外实验中，臭椿苦酮可明显抑制人早幼粒白血病 HL-60 细胞株的增殖，并且细胞相对活力呈现浓度及作用时间依赖趋势，细胞相对活力与臭椿苦酮浓度及作用时间均呈反比，随着浓度增加和作用时间延长，细胞增殖活性降低（图 1.B）；本实验中，臭椿苦酮作用于 HL-60 细胞 24、48、72h 的 IC50 值分别为 12.18、8.497、5.986μM。图 1 臭椿苦酮抑制 HL-60 细胞增殖（A.臭椿苦酮结构式；B.臭椿苦酮抑制人早幼粒白血病 HL-60 细胞株增殖，细胞相对活力呈现浓度及作用时间依赖趋势）2 臭椿苦酮诱导HL-60细胞凋亡Annexin V-APC/7-ADD 双染实验用于评估臭椿苦酮对 HL-60 细胞诱导凋亡的作用，流式细胞仪分析结果显示，臭椿苦酮处理的 HL-60 细胞凋亡比例明显上升（图2.A）。在 37℃恒温下用臭椿苦酮（5、10、20μM）处理 HL-60 细胞 48 小时后
流式细胞仪分析结果显示，臭椿苦酮处理的 HL-60 细胞凋亡比例明显上升（图2.A）。在 37℃恒温下用臭椿苦酮（5、10、20μM）处理 HL-60 细胞 48 小时后，细胞凋亡比例从 42.02 上升到 59.68%，其中细胞凋亡百分比分别是 42.02±0.54，52.05±2.27，59.69±0.25%，均显著高于对照组的 3.92±0.14%（P<0.05；图 2.B）。3 臭椿苦酮诱导HL-60细胞周期阻滞为了明确臭椿苦酮对 HL-60 细胞的抗增殖作用是否可归因于细胞周期阻滞，运用
图 3 臭椿苦酮诱导 HL-60 细胞 G0/G1 周期阻滞。（A.臭椿苦酮诱导 HL-60 细胞 G0/G 周期阻滞。PI 对 HL-60 细胞进行染色，运用流式细胞仪分析细胞周期分布。（a）对照细胞组; 用（b）5，（c）10 和（d）20μM 臭椿苦酮分别在 37 C 下处理细胞 48 小时。（B）实验数据显示，臭椿苦酮以剂量依赖的方式增加 G0/G1 期细胞的百分比；*P<0.05 对比对照组；***P<0.05 对比 5μM 组；##P<0.05 对比 10μM 组。）
本文编号：2760152
【学位授予单位】：皖南医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R285
【图文】：
结 果1 臭椿苦酮抑制HL-60细胞增殖1.1 臭椿苦酮结构式（图1.A）。1.2 MTT 实验用于评估臭椿苦酮的细胞毒性对 HL-60 细胞株增殖的影响；实验结果表明，在体外实验中，臭椿苦酮可明显抑制人早幼粒白血病 HL-60 细胞株的增殖，并且细胞相对活力呈现浓度及作用时间依赖趋势，细胞相对活力与臭椿苦酮浓度及作用时间均呈反比，随着浓度增加和作用时间延长，细胞增殖活性降低（图 1.B）；本实验中，臭椿苦酮作用于 HL-60 细胞 24、48、72h 的 IC50 值分别为 12.18、8.497、5.986μM。图 1 臭椿苦酮抑制 HL-60 细胞增殖（A.臭椿苦酮结构式；B.臭椿苦酮抑制人早幼粒白血病 HL-60 细胞株增殖，细胞相对活力呈现浓度及作用时间依赖趋势）2 臭椿苦酮诱导HL-60细胞凋亡Annexin V-APC/7-ADD 双染实验用于评估臭椿苦酮对 HL-60 细胞诱导凋亡的作用，流式细胞仪分析结果显示，臭椿苦酮处理的 HL-60 细胞凋亡比例明显上升（图2.A）。在 37℃恒温下用臭椿苦酮（5、10、20μM）处理 HL-60 细胞 48 小时后
流式细胞仪分析结果显示，臭椿苦酮处理的 HL-60 细胞凋亡比例明显上升（图2.A）。在 37℃恒温下用臭椿苦酮（5、10、20μM）处理 HL-60 细胞 48 小时后，细胞凋亡比例从 42.02 上升到 59.68%，其中细胞凋亡百分比分别是 42.02±0.54，52.05±2.27，59.69±0.25%，均显著高于对照组的 3.92±0.14%（P<0.05；图 2.B）。3 臭椿苦酮诱导HL-60细胞周期阻滞为了明确臭椿苦酮对 HL-60 细胞的抗增殖作用是否可归因于细胞周期阻滞，运用
图 3 臭椿苦酮诱导 HL-60 细胞 G0/G1 周期阻滞。（A.臭椿苦酮诱导 HL-60 细胞 G0/G 周期阻滞。PI 对 HL-60 细胞进行染色，运用流式细胞仪分析细胞周期分布。（a）对照细胞组; 用（b）5，（c）10 和（d）20μM 臭椿苦酮分别在 37 C 下处理细胞 48 小时。（B）实验数据显示，臭椿苦酮以剂量依赖的方式增加 G0/G1 期细胞的百分比；*P<0.05 对比对照组；***P<0.05 对比 5μM 组；##P<0.05 对比 10μM 组。）
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