补阳还五汤对实验性自身免疫性脑脊髓炎单核巨噬细胞的免疫调控研究

发布时间：2020-07-24 11:42

【摘要】：目的:本课题以雌性C57BL/6小鼠为对象,应用髓鞘少突胶质细胞糖蛋白35-55多肽(myelin oligodendrocyte glycoprotein peptides,MOG_(35-55))对实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE)模型进行制备,运用补阳还五汤(Buyang Huanwu decoction,BYHWD)灌胃进行干预,观察对照组和治疗组的临床症状、病理变化及BYHWD对小鼠中枢神经系统(central nervous system,CNS)脊髓、外周免疫系统脾脏单核巨噬细胞的影响。探讨BYHWD治疗EAE的有效性及对单核巨噬细胞免疫调控的作用及机制。方法:雌性C57BL/6小鼠42只,用小鼠MOG_(35-55)多肽免疫制备成EAE的模型,按照随机数字分配表将小鼠分为EAE对照组、BYHWD治疗组,每个组各有21只动物。在免疫后的第3天开始进行灌胃给药,EAE对照组予以自来水、BYHWD治疗组给予BYHWD,500μl/只/d(含原药1g),持续观察临床症状和体重变化。免疫后17天(p.i.17)各组统一处死9只动物,无菌分离脾脏,5只用于制备脾脏单个核细胞混悬液,流式细胞术(Flow CytoMetry,FCM)检测脾脏单核巨噬细胞M1型和M2型细胞亚型;4只脾脏经脱水后制成冰冻切片进行免疫荧光组织化学染色,检测iNOS、Arginase-1的表达。脊髓冰冻切片进行HE染色观察炎性细胞浸润情况,罗氏染色观察脊髓髓鞘脱失比例,免疫荧光组织化学染色、Western blot法检测脊髓巨噬细胞iNOS、TNF-α、Arginase-1及IL-10的表达。运用统计分析软件Graphpad Prism 6.0对实验结果进行分析处理。结果:1.C57BL/6小鼠由MOG_(35-55)抗原乳剂免疫诱导后EAE小鼠模型成功建立。从平均起病时间来看,BYHWD组较EAE对照组而言,起病时间明显推迟,临床症状评分明显降低;同时,BYHWD治疗组可明显抑制EAE小鼠在发病期间的体重减轻(p0.01)。2.BYHWD治疗后可减轻EAE小鼠脊髓的髓鞘脱失程度(p0.05)。3.HE染色和免疫荧光组织化学染色观察到EAE脊髓有不同程度的炎性细胞浸润。BYHWD可以减轻CNS CD68~+单核巨噬细胞及炎性细胞的浸润(p0.05)。4.EAE小鼠经BYHWD治疗后,可显著抑制脊髓及脾组织中巨噬细胞iNOS、TNF-α、CD16/32的表达,同时促进Arg-1、IL-10、CD206的表达(p0.05)。结论:1.BYHWD对EAE具有较好的治疗效果,可以延缓EAE的发病程度,减轻EAE小鼠精神萎靡、食欲不振、四肢痿弱甚至瘫痪等中医“痿症”的临床症状。2.BYHWD可减轻EAE髓鞘脱失,抑制炎性细胞浸润,促进髓鞘再生。3.BYHWD促进EAE脊髓及脾组织中M1型巨噬细胞转化为M2型。其疗效机制可能与其抗炎、诱导巨噬细胞极性转化相关。
【学位授予单位】：山西中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R285.5
【图文】：

后角,脊髓,白质,巨噬细胞

15图 3 BYHWD 抑制 EAE 小鼠脊髓组织中巨噬细胞浸润（注：A 中 1 表示脊髓的后角，2 表示脊髓白质外侧区；应用 Image-Pro 软件进行统计，Mean SD， n=4，* p<0.05 vs EAE group）2.4 BYHWD 促进 EAE 脊髓组织中 M1 型巨噬细胞转化为 M2 型根据表型及分泌细胞因子功能的不同，可将巨噬细胞分为 M1 型、M2 型。M1型巨噬细胞主要分泌促炎因子，促进炎症进一步发展；M2 型巨噬细胞则通过修复组织使炎性反应降低。本课题选取 iNOS、TNF-α、Arg-1、IL-10 为代表进行研究，荧

印迹法,免疫荧光染色,巨噬细胞,脊髓

山西中医药大学 2017 届硕士学位论文光显微镜下观察到，在炎症反应严重的 EAE 组脊髓白质区可见 iNOS、TNF-α 阳性表达较多，成大片点状分布；BYHWD 组分布少，仅有零星阳性浸润（p<0.05）。Arg-1、IL-10 的表达则与 iNOS、TNF-α 相反，与 EAE 对照组相比，在 BYHWD 治疗组的阳性分布比较多而密集，两组比较差异明显(p<0.05)（图 4A）。同时将脊髓蛋白用Western 印迹法检测，谱带及统计结果显示：与治疗组相比，iNOS、TNF-α在 EAE 对照组脊髓蛋白细胞内表达量高，Arg-1、IL-10 在 EAE 对照组脊髓蛋白细胞内表达量低(p<0.05)（图 4B）。

【参考文献】