杜鹃素新结构活性衍生物在血管内皮EA.hy926细胞中亲和蛋白的初步研究

发布时间：2020-07-25 07:17

【摘要】：目的:药物靶标的发现是新药创制的源头。课题组设计合成中药有效成分杜鹃素新结构衍生物(DJS-F,DJS-2Cl,DJS-NO2),其血管内皮细胞保护作用均明显优于先导物杜鹃素,但作用机制尚不明确。本文拟首先以人血清白蛋白(HSA)为模型蛋白,联用药物亲和蛋白稳定性筛选(DARTS)-光谱法-分子对接技术初步探讨此类化合物与生物大分子作用特性及强度差异,探索一种体外考察活性化合物作用亲和蛋白的有效方法;进而采用中空纤维细胞捕获-高效液相色谱法(HFCF-HPLC)-DARTS/SDS-PAGE/MALDI-TOF联用技术,初步考察杜鹃素新结构活性衍生物在血管内皮细胞中的亲和蛋白,为后续明确此类化合物作用靶蛋白、指导进一步结构修饰和改造提供实验基础和科学依据。方法:(1)DARTS-光谱法-分子对接联用技术考察比较杜鹃素新结构活性衍生物与HSA的结合特性及差异:将供试化合物与HSA室温孵育1 h,链酶蛋白酶裂解30 min,加入5×上样缓冲液(5×Loading Buffer),95℃煮沸5 min,SDS-PAGE分离,考马斯亮蓝染色,分析HSA条带,比较杜鹃素活性小分子与HSA作用条带强度的差异;荧光光谱法比较其结合常数;计算热力学参数确定化合物与HSA结合的作用力类型;采用三维荧光光谱和圆二色谱技术研究此类化合物对HSA二级结构的影响;利用分子对接技术预测并评价杜鹃素新结构活性衍生物与HSA相互作用模式。(2)HFCF-HPLC技术:体外培养EA.hy926细胞,以中空纤维为载体,利用完整细胞、细胞膜和细胞器,分别与杜鹃素新结构活性衍生物孵育,HPLC法检测,计算细胞不同部位对杜鹃素新结构活性衍生物的捕获因子,对其亲和蛋白进行初步定位;(3)DARTS/SDS-PAGE/MALDI-TOF-MS联用技术:提取EA.hy926细胞胞浆蛋白、质膜蛋白,分别与杜鹃素新结构活性衍生物室温孵育,链酶蛋白酶裂解,SDS-PAGE分离,MALDI-TOF质谱鉴定以及数据库检索,初步研究杜鹃素新结构活性衍生物在EA.hy926细胞的亲和蛋白。结果:(1)DARTS/SDS-PAGE实验:随着DJS浓度逐渐增大,HSA条带逐渐加深;同样浓度的杜鹃素新结构活性衍生物DJS-F、DJS-2Cl、DJS-NO2作用的HSA条带均较先导物DJS作用条带深;荧光光谱分析:DJS、DJS-F、DJS-2Cl、DJS-NO2与HSA结合常数分别为4.01×105 mol·L-1、4.39×105 mol·L-1、8.83×105 mol·L-1、4.91×105 mol·L-1,结合位点数均为1;热力学参数可知,该类化合物与HSA间的相互作用力主要为疏水作用力与氢键作用力;三维荧光光谱显示杜鹃素新结构活性衍生物的加入使得HSA的峰A和峰B的荧光强度都呈现明显下降并发生红移;圆二色谱实验:杜鹃素新结构活性衍生物的加入导致α-螺旋的含量出现下降趋势。(2)DJS,DJS-F,DJS-2Cl,DJS-NO2的细胞捕获因子(1.20、3.28、1.56、3.66)及细胞膜捕获因子(1.15、4.43、3.57、2.31)均大于1;而细胞器捕获因子(0.94、0.28、0.74、0.78)均小于1。(3)DARTS/SDS-PAGE-Western blot检出杜鹃素新结构衍生物在胞浆中的亲和蛋白GRP78,且亲和性强弱与内皮细胞保护活性趋势基本一致;DARTS/SDS-PAGE-MALDI-TOF-MS-Western blot检出杜鹃素新结构衍生物在膜蛋白中亲和蛋白之一埃兹蛋白。结论:(1)以HSA为模型蛋白,DARTS-光谱法-分子对接联用技术可作为一种体外考察活性化合物作用亲和蛋白的有效方法;(2)杜鹃素新结构活性衍生物与HSA结合特性相似,但亲和强度明显高于其先导物杜鹃素;(3)HFCF-HPLC结果显示杜鹃素新结构活性衍生物与内皮细胞及细胞膜的亲和性明显高于先导物杜鹃素,亲和性强弱与内皮细胞保护活性趋势一致,提示杜鹃素新结构活性衍生物作用亲和蛋白可能定位于细胞膜中或者胞浆中的生物大分子;(4)杜鹃素新结构活性衍生物在内皮细胞中的亲和蛋白埃兹蛋白及GRP78的发现为明确此类化合物靶蛋白、指导进一步结构修饰和改造奠定了实验基础,提供了科学依据。
【学位授予单位】：山西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R284;R285
【图文】：

化学结构

痰、抗菌、抗炎、抗肿瘤等多种生物活性[8-11]。组前期研究发现 DJS 具有良好的血管内皮保护作用，JS-2Cl, DJS-NO2)活性明显高于该先导物[12-14]，结构式见用机制及作用靶点尚不清楚，限制了其结构改造及其，明确此类药物与生物大分子结合特性并探寻药物作用的重点[15-21]。清白蛋白(Human serum albumin, HSA)是人血浆中含量体液中 HSA 可运输和储存多种内源性和外源性物质[22-2稳定且廉价易得，已有文献报道杜鹃素与 HSA 具有一定可作为研究此类化合物与生物大分子结合特性的模式结构衍生物同 HSA 相互作用的差异对于进一步研究此子的相互作用具有重要的指导意义。

化合物,相互作用,杜鹃素,衍生物

比较杜鹃素新结构活性衍生物与 HSA 的考察DS-PAGE-考染脱色后，扫描凝胶。HSA 分子量66 左右的位置出现肉眼可见的 HSA 差异条带。蛋白条带颜色明显深于溶剂对照组(DMSO)，表与 HSA 结合从而增强 HSA 蛋白酶抗性，保护四种化合物 DJS，DJS-F，DJS-2Cl，DJS-NO2作带均深于空白组，表明四种杜鹃素新结构活性衍合。由图 1-1 也可看出各衍生物组与蛋白孵育后生物 DJS-F，DJS-2Cl，DJS-NO2与 HSA 结合力

相互作用,链霉蛋白酶,酶浓度,给药

1-2 不同浓度的 DJS 与 HSA 相互作用 DARTS-SDS-PAGE 结果-2 Results of interaction between DJS with different concentration aDART-SDS-PAGE assay (n=3)度影响结果S-SDS-PAGE-考染脱色后，扫描凝胶，如图 1-3 所示，加，HSA 条带变浅；在不同的酶浓度的作用下，给药相应的溶剂对照组，表明 DARTS 技术可以用来检测 D。1-3 给予不同浓度的链霉蛋白酶时 DARTS-SDS-PAGE 结果 (n

【参考文献】