人参三七川芎提取物调控线粒体自噬延缓血管内皮细胞衰老的机制研究

发布时间：2020-07-25 13:25

【摘要】：糖尿病是以糖脂代谢紊乱为主要临床特征的慢性代谢性疾病,其中心血管疾病是糖尿病的主要并发症,约60%的糖尿病患者死于心血管并发症。越来越多的证据表明,糖脂代谢紊乱引发的血管内皮细胞衰老是导致内皮功能紊乱及心血管疾病的关键。衰老的血管内皮细胞能够活化和分泌大量促炎细胞因子,促进慢性炎症扩散、单核细胞聚集和血栓形成,加速血管内皮功能紊乱和糖尿病心血管疾病形成。因此,探讨高糖高脂环境下血管内皮细胞衰老的病理机制,寻找靶向干预衰老细胞的治疗措施,对糖尿病及心血管并发症的防治意义重大。糖尿病患者体内高糖高脂刺激损伤了血管内皮细胞内线粒体,导致细胞内活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)累积,诱导长期氧化应激反应,加速血管内皮细胞衰老形成。线粒体自噬是选择性自噬的一种形式,它可以标记受损的线粒体,并对其进行自动识别和降解,从而改善线粒体结构和功能的完整性,阻止线粒体来源的ROS的过度累积,进而在延缓细胞衰老过程中发挥保护作用。AMPK/mTOR信号通路作为经典的线粒体自噬调控通路,也参与了多种心血管和衰老相关疾病的发生发展过程。因此,调控AMPK/mTOR信号通路介导的线粒体自噬有望成为延缓血管内皮细胞衰老的新策略。中药人参、三七、川芎均属于益气活血药的范畴,临床广泛应用于心脑血管疾病的防治。既往药理学研究显示,上述三种中药的多种活性成分均具有良好的抗衰老功效。本课题组前期研究表明,在复制型和诱导型的血管内皮细胞衰老中,人参三七川芎提取物均能有效降低细胞内ROS水平,发挥延缓细胞衰老的作用。但是,在高糖高脂诱导的血管内皮细胞衰老中,人参三七川芎提取物是否能有效地抑制细胞衰老的发生发展?其具体机制是否与线粒体自噬和AMPK/mTOR信号通路有关?上述科学问题均有待进一步探索。基于此,我们提出以下科学假说:人参三七川芎提取物可能通过调控AMPK/mTOR信号通路介导的线粒体自噬延缓高糖高脂诱导的血管内皮细胞衰老。围绕上述假说,本研究首先基于网络药理学研究,预测人参、三七和川芎延缓血管衰老的可能作用靶点和分子机制,然后以糖尿病小鼠主动脉和人主动脉内皮细胞为研究对象,以线粒体自噬与AMPK/mTOR信号通路为切入点,探索人参三七川芎提取物与高糖高脂诱导的血管内皮细胞衰老之间的关系,旨在从网络药理、整体动物和细胞分子三个水平阐述人参三七川芎提取物延缓血管内皮细胞衰老的作用及机制。研究一人参三七川芎延缓血管衰老的网络药理学研究目的:基于网络药理学分析人参、三七和川芎延缓血管衰老可能的作用靶点和分子机制。方法:检索中药系统药理数据库和分析平台(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform,TCMSP)数据库,以口服生物利用度(oral bioavailability,OB)和类药性(drug-likeness,DL)为限定条件对人参、三七和川芎所含的活性成分进行筛选,并预测作用靶点;利用Cytoscape 3.7.1构建药物活性成分-靶点网络、成分靶点相互作用网络和血管衰老相关靶点蛋白相互作用网络;采用BisoGenet插件,将上述中药活性成分作用靶点和人类血管衰老相关疾病靶点进行相互作用关系网络绘制,抽取获得人参、三七和川芎延缓血管衰老的关键靶标;采用ClueGO分析插件,将上述筛选得到的关键靶标进行KEGG信号通路富集分析。结果:通过TCMSP数据库,以OB≥30%和DL≥0.18为参数从中药人参、三七和川芎中收集到了 33个入血活性成分,130个预测靶点;从NCBI、AgeFactDB和HAGR数据库筛选获得146个人血管衰老相关基因;构建中药调控血管衰老的蛋白质相互作用交集网络,通过拓扑属性分析筛选获得253个关键靶标;ClueGO富集分析显示人参、三七和川芎延缓血管衰老的机制涉及细胞周期、长寿调节通路、FoxO信号通路、神经营养因子信号通路、线粒体自噬等多种生物过程。结论:人参、三七和川芎延缓血管衰老具有多成分、多途径和多靶点综合调控的作用特点,其中线粒体自噬很可能是关键调控点之一。研究二人参三七川芎提取物对高糖高脂环境下血管组织和血管内皮细胞衰老的影响目的:观察人参三七川芎提取物对糖尿病小鼠主动脉衰老和高糖高脂诱导血管内皮细胞衰老的影响。方法:通过腹腔注射链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)联合高脂饮食喂养构建糖尿病小鼠模型,造模28 w后给予药物干预9 w,实验分为空白对照组、衰老模型组、人参三七川芎提取物低(0.819 g/kg)、高(1.638 g/kg)剂量组和二甲双胍组(150 mg/kg)。利用生化分析小鼠血糖血脂变化,细胞衰老β-半乳糖苷酶(senescence associated β-galactosidase,SA-β-gal)染色法计算蓝染组织比例,免疫组化和Western blot检测p16和p21蛋白表达情况。体外实验采用40mM葡萄糖(high glucose,HG)和 100μM 棕榈酸(palmitic acid,PA)干预 48h 诱导人主动脉内皮细胞(Human Aortic Endothelial Cells,HAEC)衰老模型,实验分为空白对照组、衰老模型组、人参三七川芎提取物不同剂量组和二甲双胍组。采用CCK-8检测细胞增殖活力,SA-β-gal染色检测细胞衰老程度,Western blot检测细胞p16、p21蛋白表达水平的变化,免疫荧光检测Y-H2A.X(Ser139)表达、线粒体ROS(mitochondrial ROS,mtROS)生成和线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential,MMP)变化。结果:(1)与空白对照组相比,衰老模型组小鼠随机血糖、胆固醇和低密度脂蛋白水平显著升高,高密度脂蛋白水平降低,主动脉组织SA-β-gal蓝染比例增加,p16、p21蛋白表达水平升高(P0.05);药物干预后,小鼠血糖水平降低(P0.05),各项血脂指标改变不明显,主动脉组织SA-β-gal蓝染比例明显降低(P0.05),p16、p21蛋白表达水平下调(P0.05)。(2)体外实验中,与空白对照组相比,衰老模型组HAEC细胞增殖活力、MMP水平降低(P0.05),SA-β-gal蓝染细胞数量和mtROS生成增加,p16、p21和Y-H2A.X(Ser139)蛋白表达水平升高(P0.05);与衰老模型组比较,人参三七川芎提取物组和二甲双胍组中HAEC细胞增殖活力和MMP水平增加(P0.05),SA-β-gal蓝染细胞数量和mtROS生成减少(P0.05),p16、p21和Y-H2A.X(Ser139)的表达水平显著降低(P0.05)。结论:长期高糖高脂刺激可加速小鼠主动脉和HAEC细胞衰老进程,而人参三七川芎提取物能够同时延缓血管组织和HAEC细胞衰老,且对HAEC细胞线粒体功能和mtROS的生成有明显干预作用,其可能通过此作用抑制了血管内皮细胞衰老的进程。研究三人参三七川芎提取物调控线粒体自噬抑制血管内皮细胞衰老的作用目的:观察人参三七川芎提取物在血管内皮细衰老中对线粒体自噬的影响,并特异性抑制线粒体自噬,进一步探讨人参三七川芎提取物抑制细胞衰老的可能机制。方法:采用HG 40mM联合PA 100μM干预48h诱导HAEC细胞衰老模型,实验分为空白对照组、衰老模型组、人参三七川芎提取物组和二甲双胍组。采用GFP-LC3与mitotracker荧光共定位检测评估线粒体自噬体的形成,Parkin与mitotracker荧光共定位检测评估Parkin蛋白转位情况,Western blot检测线粒体自噬相关蛋白PINK1、Parkin、LC3B-Ⅱ、p62和衰老相关蛋白p16、p21的表达水平,CCK-8检测细胞增殖活力,SA-β-gal染色检测细胞衰老程度,免疫荧光检测γ-H2A.X(Ser139)表达、mtROS 生成和 MMP 变化。结果:(1)与空白对照组相比,衰老模型组HAEC细胞中GFP-LC3与mitotracker共定位程度下降,Parkin蛋白表达与转位程度下调,p62表达增加;与衰老模型组相比,人参三七川芎提取物组GFP-LC3、Parkin与mitotracker共定位程度增加(P0.05),Parkin和LC3B-Ⅱ的表达水平上调(P0.05),而p62表达水平下调(P0.05);二甲双胍组GFP-LC3与mitotracker共定位程度和Parkin、LC3B-Ⅱ蛋白表达水平均上调(P0.05)。(2)给予Mdivi-1抑制线粒体自噬,与衰老模型组相比,人参三七川芎提取物组GFP-LC3和mitotracker共定位程度、Parkin的表达和转位情况均未发生改变;LC3B-Ⅱ和p62表达水平上调(P0.05);mtROS生成、MMP水平、细胞增殖活性、SA-β-gal蓝染细胞数量和p16、p21、γ-H2A.X(Ser139)蛋白表达差异均无统计学意义。结论:高糖高脂刺激可抑制HAEC细胞线粒体自噬,人参三七川芎提取物能够恢复HAEC细胞线粒体自噬能力,这可能是其发挥改善线粒体功能、减少mtROS生成和延缓细胞衰老的重要机制之一。研究四人参三七川芎提取物通过AMPK/mTOR通路发挥线粒体自噬调控作用目的:观察人参三七川芎提取物在血管内皮细衰老中对AMPK/mTOR信号通路的影响。通过特异性干扰AMPK活性与表达,进一步探讨人参三七川芎提取物调控线粒体自噬及延缓细胞衰老的作用机制。方法:采用HG 40mM联合PA 100μM干预48h诱导HAEC细胞衰老模型,实验分为空白对照组、衰老模型组、人参三七川芎提取物组和二甲双胍组。采用Western blot检测p-AMPK、AMPK、p-mTOR、mTOR、p-p70S6K和p70S6K蛋白表达;采用Compound C和AMPKα1 shRNA慢病毒颗粒干扰AMPK活性和表达,在此基础上,观察对人参三七川芎提取物调控AMPK/mTOR信号通路、线粒体自噬和细胞衰老程度作用的影响。结果:(1)与空白对照组相比,衰老模型组HAEC细胞中AMPK蛋白和磷酸化(Thr172)水平下调,mTOR和p70S6K蛋白磷酸化水平上调;药物干预后,可有效上调AMPK蛋白表达及磷酸化水平,下调mTOR和p70S6K蛋白磷酸化水平,具有统计学意义。(2)给予Compound C抑制AMPK活性,与衰老模型组相比,药物干预后,AMPK、mTOR和p70S6K磷酸化水平没有差异;未能增加HAEC细胞中LC3、Parkin与线粒体的结合程度;PINK1、Parkin、p62和LC3B-Ⅱ的表达差异无统计学意义;HAEC细胞增殖活力、SA-β-gal细胞蓝染数量、mtROS生成以及p16、p21和γ-H2AX蛋白表达方面尚未有差异。(3)采用RNAi技术特异性干扰AMPKα1蛋白表达,与阴性对照组(SCR shRNA)比较,AMPKα1 shRNA转染细胞中AMPK蛋白表达及磷酸化水平显著下调,同时mTOR和p70S6K磷酸化水平上调;Parkin蛋白表达水平显著下调,p62蛋白表达水平上调;细胞增殖活力水平下降,SA-β-gal细胞蓝染数量、mtROS生成以及p16、p21和γ-H2AX蛋白表达增加。(4)在AMPKα1 shRNA干扰细胞中,与衰老模型组相比,人参三七川芎提取物组中AMPK蛋白表达和磷酸化水平无统计学差异,mTOR和p70S6K磷酸化水平下调,但是其下调程度较结果(1)中明显减弱;PINK1、Parkin和LC3B-Ⅱ蛋白表达水平未有明显差异,p62蛋白水平明显下调;细胞增殖活力、SA-β-gal细胞蓝染数量、mtROS生成以及p21蛋白表达方面尚未有差异,但p16和γ-H2AX蛋白水平明显下调。结论:AMPK/mTOR信号通路在高糖高脂诱导的衰老HAEC细胞中呈抑制状态,人参三七川芎提取物可激活该通路,这是其发挥激活线粒体自噬和拮抗细胞衰老作用的重要机制之一。综上所述,本研究利用糖尿病小鼠模型和HG/PA联合诱导的HAEC细胞衰老模型,证明人参三七川芎提取物可呈剂量依赖性的延缓血管内皮细胞衰老,以往未见报道。在此基础上,本研究基于“AMPK/mTOR信号通路-线粒体自噬-线粒体功能障碍”轴阐明了高糖高脂环境下人参三七川芎提取物延缓血管内皮细胞衰老的效应机制,为糖尿病及心血管疾病的中医药防治提供了新的思路。
【学位授予单位】：中国中医科学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R285.5
【图文】：

网络图,中药活性成分,网络图,靶点

为了更好地理解中药活性成分与对应靶点之间复杂的相互作用关系，本研究逡逑以上述活性成分和靶点为基础，采用网络图形化工具Ｃｙｔｏｓｃａｐｅ进行绘制和分析，逡逑建立了成分靶点网路图。该网络包含了邋１５８个节点和６４５个关系（

维恩图,血管,个人,相关性

库之间的重复的衰老相关基因之后，获得丫邋３０９个人衰老相关基因。最后汇集了逡逑１７２６个人血管相关基因和３０９个人衰老相关基因，并生成了邋１４６个人血管衰老逡逑相关基因，用于基于系统药理学的分析（

网络图,中药,血管,网络图

蛋白质相互作用网络，进一步深入分析中药人参、三七和川芎影响血管衰老发生、逡逑发展的靶点，绘制蛋白质相互作用靶点的交集网络，为中药干预血管衰老的机制逡逑探讨提供了可靠依据（图３）。逡逑、：－－逡逑？邋＊逦ｒ逡逑＾逦－邋．Ｖ、、逡逑？ｌ邋？邋？邋＞逡逑．＇邋．Ｖ－逡逑？＂Ｖ．少、？逡逑４邋．邋－，逦．逡逑图３中药－血管衰老交集网络图逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋３．邋Ｃｈｉｎｅｓｅ邋ｍｅｄｉｃｉｎｅ－ｖａｓｃｕｌａｒ邋ａｇｉｎｇ邋ｉｎｔｅｒｓｅｃｔｉｏｎ邋ｎｅｔｗｏｒｋ逡逑４．２中药调控血管衰老的关键靶点逡逑通过对中药人参、三七和川芎调控血管衰老的蛋白质相互作用交集网络和网逡逑络节点的拓扑属性分析进行节点筛选，寻找网络中的关键靶点。本研究筛选获得逡逑２５３个节点和９１３５条边，其中２５３个节点即为中药人参、三七和川芎调控血管逡逑衰老的２５３个关键靶点（图４）。逡逑４２逡逑

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