枳实对内质网应激Cajal间质细胞GRP78、ATF6的影响

发布时间：2020-07-29 08:36

【摘要】：目的:探讨枳实对衣霉素诱导的Cajal间质细胞内质网应激分子GRP78、ATF6的影响。方法:(1)采用酶解法分离原代大鼠胃间质细胞(Interstitial cells of Cajal,ICCs),免疫荧光染色法鉴定ICCs细胞c-kit抗体;采用CCK-8法检测不同浓度(0μg/ml、0.125μg/ml、0.25μg/ml、0.5μg/ml、1μg/ml、2μg/ml)衣霉素(Tunicamycin,Tm)作用于ICCs不同时间(12h、24h、48h)对细胞活性的影响;qRT-PCR法检测ICCs内质网应激关键分子GRP78 mRNA的表达;透射电子显微镜观察ICCs的内质网超微结构。(2)枳实对内质网应激ICCs的影响:采用血清药理学通法制备枳实含药血清,抑制剂4-PBA阻断内质网应激。随机将细胞分为:空白对照组(ICCs正常培养)、Tm模型组(1μg/ml Tm处理ICCs)、4-PBA组(1μg/ml TM+10mM 4-PBA联合作用)和枳实组(1μg/ml Tm+20%枳实含药血清联合作用),每组细胞均作用24h后用于检测:采用透射电子显微镜观察各组ICCs的内质网超微结构;微板法测定各组ICCs的乳酸脱氢酶(LDH)活性;荧光酶标仪测定各组ICCs的ROS水平;CCK-8法检测各组ICCs的细胞活性;细胞划痕实验观察各组ICCs细胞的迁移修复能力;Elisa法、qRT-PCR法、Western blot法检测内质网应激相关分子GRP78和ATF6的表达。结果:(1)光镜下ICCs呈梭形、三角形、星型等,伴有细长的分枝状突起,细胞质较少,胞核大,与周围细胞间形成突触链接,免疫荧光染色法可见c-kit呈阳性表达;采用CCK-8法检测Tm对细胞活性的影响:当Tm浓度为2μg/ml时,Tm作用于ICCs 12h、24h、48h时细胞活性均降低,12h、24h、48h细胞活性(OD值)分别为0.553±0.026(P0.05)、0.466±0.046(P0.05)、0.164±0.034(P0.05);当Tm浓度为1μg/ml,Tm作用于ICCs 24h、48h时细胞活性均降低,24h、48h细胞活性(OD值)分别为0.736±0.008(P0.05)、0.359±0.079(P0.05);qRT-RCR结果显示:与0μg/ml Tm比较,1μg/ml Tm作用于ICCs 24h后,内质网应激关键分子GRP78 mRNA表达升高,且有统计学意义(P0.05);透射电子显微镜结果显示:空白对照组ICCs培养24h后,细胞内质网结构形态完整,排列整齐;1μg/ml Tm作用于ICCs 24h后,细胞内质网结构肿胀、扩张、断裂、呈囊泡化、脱颗粒改变。(2)枳实对内质网应激ICCs的影响:透射电子显微镜结果显示,空白对照组ICCs内质网结构完好,Tm模型组ICCs内质网肿胀、扩张、呈囊泡化、脱颗粒改变,4-PBA组ICCs内质网断裂、扩张,枳实组ICCs内质网肿胀、呈局限性扩张;各组ICCs的LDH活性比较:与空白对照组比较,Tm模型组、4-PBA组、枳实组细胞LDH活性均升高(P0.05);与Tm模型组比较,4-PBA组、枳实组细胞LDH活性均降低(P0.05);各组ICCs的ROS含量比较:与空白对照组比较,Tm模型组、4-PBA组、枳实组细胞ROS含量均升高(P0.05);与Tm模型组比较,4-PBA组、枳实组细胞内ROS含量均降低(P0.05);在倒置荧光显微镜下可见,Tm模型组细胞内的荧光强度较强;而经抑制剂、枳实含药血清处理后细胞内的荧光强度减弱;各组ICCs存活率比较:与空白对照组比较,其余各组ICCs的存活率均降低(P0.05);与Tm模型组比较,枳实组ICCs的存活率升高(P0.05);细胞划痕实验结果显示:相同时段内ICCs组细胞间距随着随时间推移缩小。培养12h后,空白对照组细胞划痕愈合率为(38.0±2.0)%、Tm模型组细胞划痕愈合率为(19.7±4.5)%、4-PBA组细胞划痕愈合率为(26.3±3.7)%、枳实组细胞划痕愈合率为(30.0±2.0)%;培养24h后,空白对照组细胞划痕愈合率为(31.0±2.0)%、Tm模型组细胞划痕愈合率为(7.0±3.6)%、4-PBA组细胞划痕愈合率为(35.7±2.1)%、枳实组细胞划痕愈合率为(38.3±3.1)%;与Tm模型组相比,枳实组ICCs划痕愈合率高(P0.05);Elisa法检测各组细胞GRP78、ATF6蛋白含量结果显示:与空白对照组比较,Tm模型组、4-PBA组、枳实组GRP78、ATF6蛋白含量均升高(P0.05);与Tm模型组比较,4-PBA组、枳实组的GRP78、ATF6蛋白含量均降低(P0.05);qRT-PCR法检测GRP78、ATF6mRNA表达结果,与空白对照组比较,Tm模型、4-PBA组、枳实组GRP78、ATF6 mRNA表达均升高(P0.05);与Tm模型组比较,枳实组GRP78、ATF6 mRNA表达均降低(P0.05);与4-PBA组比较,枳实组GRP78 mRNA表达降低(P0.05);Western blot法检测各组细胞GRP78、ATF6蛋白表达结果,与空白对照组比较,Tm模型组、4-PBA组、枳实组GRP78、ATF6蛋白表达均升高(P0.05);与Tm模型组比较,4-PBA组、枳实组的GRP78、ATF6表达均降低(P0.05)。结论:使用衣霉素成功构建大鼠胃ICCs细胞内质网应激的模型;枳实可减轻由衣霉素诱导的ICCs内质网应激损伤,提高受损细胞生长活性、改善细胞运动修复能力,这可能与其抑制内质网应激ATF6通路有关。
【学位授予单位】：广西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R285.5
【图文】：

图 1-1 ICCs 生长形态及免疫荧光鉴定（×100）Fig.1-1 Morphology and immunofluorescence identification of ICCs (×100).1.2 ICCs 细胞生长及形态观察

2 不同培养时间的 ICCs 细胞形态2 The ICCs morphology at different culture timesculh 后 ICCs（×100） B 3d 后 ICCs（×100）eight hours later, ×100） ICCs（three days later, ×100）d 后 ICCs（×100） D 7d 后 ICCs（×100）five days later, ×100） ICCs（seven days later, ×100）构建 ICCs 内质网应激细胞模型1 Tm 对 ICCs 活性的影响CCK8 结果显示，当 Tm 浓度为 2μg/ml 时，ICCs 存活率显著下降m 浓度升高，ICCs 存活率逐渐下降，而 Tm 浓度为 0μg/ml、0.125μgμg/ml、0.5μg/ml 时，各组细胞存活率无显著差异。当 Tm 浓度为 1μg 24h、48h，细胞存活率均降低（P＜0.05），考虑到诱导内质网应

3.2.3 透射电子显微镜观察 ICCs 内质网超微结构变化结果如图 1-3 所示，空白对照组 ICCs 内可见内质网形态完整、排列整齐，如图 1-3A；当 Tm 浓度为 1μg/ml Tm，作用于 ICCs24h 后，ICCs 内质网肿胀、扩张、呈囊泡化、相互离散及脱颗粒改变，内质网结构破坏明显，

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本文编号：2773712