草苁蓉环烯醚萜苷对肝癌的抑制作用及其机制的实验研究

发布时间：2020-07-30 20:26

【摘要】：目的:1.研究草苁蓉环烯醚萜苷(IGBR)含药血清对人肝癌SMMC-7721、HepG2和SK-Hep1细胞生长的抑制作用。2.研究IGBR含药血清诱导人肝癌SMMC-7721细胞凋亡的作用,探讨其作用机制。3.观察二乙基亚硝胺(DEN)诱发肝癌大鼠的肝功能和肝组织病理变化,研究IGBR的抗氧化和诱导细胞凋亡的作用,探讨其作用机制。方法:1.体外实验:(1)含药血清的制备:雄性Wistar大鼠每组6只,随机分为对照组、5-氟尿嘧啶(5-FU)组、IGBR低、中、高剂量组。每日1次给予对照组大鼠2mL生理盐水,5-FU组大鼠75mg/kg 5-FU,IGBR组大鼠分别给予 125mg/kg、250mg/kg、500mg/kgIGBR连续灌胃1个月后处死各组大鼠,采集心脏血液,3 000转离心20min,56℃恒温水浴30 min,灭活血清中的补体及其他活性成分,-20℃保存备用。(2)体外培养人肝癌SMMC-7721、HepG2和SK-Hep1细胞株,以常规化疗药物5-FU为阳性对照,通过四甲基偶氮唑蓝法(MTT法)检测肝癌细胞增殖能力,流式细胞术检测细胞凋亡率,荧光显微镜观察肝癌细胞形态变化,蛋白印迹法(Western Blot)检测细胞凋亡相关蛋白的表达。2.体内实验:(1)DEN诱发大鼠原发性肝癌模型的制备:雄性Wistar大鼠每组33只,随机分为对照组、肝癌组、5-FU组及IGBR组。造模第一天对照组大鼠给予腹腔注射1次0.1 mL/100 g生理盐水,余3组大鼠给予腹腔注射1次200 mg/kg DEN;然后给予各组大鼠0.05%的DEN水溶液自由饮用。第二天开始5-FU组大鼠每周腹腔注射3次25 mg/kg 5-FU;IGBR组大鼠每日灌胃1次500 mg/kg IGBR。实验第12、20周末各组大鼠均处死6只,第28周末各组大鼠均处死20只,采集心脏血液,福尔马林固定肝脏。(2)以全自动生化分析仪检测大鼠肝功能;谷胱甘肽-S-转移酶(GST)和γ-谷氨酰转肽酶(γ-GT)的含量参照试剂盒操作步骤进行测定;用比色法测定肝组织抗氧化酶活性;通过HE染色观察肝组织病理变化、利用原位末端转移酶标记技术(TUNEL)检测肝细胞凋亡率、Western Blot法检测细胞凋亡相关蛋白的表达。结果:1.体外实验:(1)5-FU含药血清和IGBR含药血清能够抑制人肝癌SMMC-7721、HepG2和SK-Hep1细胞的增殖,有浓度和时间依赖性。(2)5-FU含药血清和IGBR含药血清作用于人肝癌SMMC-7721细胞后,出现细胞皱缩、变圆、细胞核固缩等典型的细胞凋亡改变;与对照组相比,5-FU组和IGBR组细胞凋亡率上升,差异有统计学意义(P0.05),IGBR高剂量组和5-FU组间无明显统计学差异(P0.05)。(3)5-FU含药血清和IGBR含药血清作用于人肝癌SMMC-7721细胞后,与对照组相比5-FU组和IGBR中、高剂量组半胱天冬氨酸蛋白-3(Caspase-3)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、磷酸化c-jun氨基末端激酶(p-JNK)、磷酸化p38MAPK激酶(p-p38)蛋白表达增多,而B细胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)、磷酸化细胞外信号调节激酶(p-ERK)、磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)蛋白表达减少,差异均有统计学意义(P0.05),IGBR高剂量组和5-FU组间无明显统计学差异(P0.05);但ERK、JNK、p38、Akt蛋白表达无显明变化。采用丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)和磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)抑制剂分别作用后进一步证实IGBR含药血清通过调节上述信号传导通路,抑制肝癌细胞的生长,诱导细胞凋亡。2.体内实验:(1)给予大鼠灌胃DEN28周后,成功诱发原发性肝癌大鼠模型。与对照组相比,肝癌组大鼠毛发无光泽、粗糙、精神萎靡不振,肝重下降呈暗红色、质地坚硬、肝结节融合形成包块;与肝癌组相比,IGBR组和5-FU组大鼠上述变化较轻,但肝重无明显变化。(2)与对照组相比,肝癌组丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)活性、GST、γ-GT含量和肝组织抗氧化酶水平增高,差异均有统计学意义(P0.05);与肝癌组相比,5-FU组与IGBR组大鼠血清ALT和AST活性、GST、γ-GT含量和肝组织抗氧化酶水平降低,差异均有统计学意义(P0.05),IGBR组和5-FU组间无明显统计学差异(P0.05)。(3)HE染色结果:肝癌组大鼠肝组织病理改变主要表现为肝脏炎症反应、肝硬化和肝癌三个阶段。与对照组相比,肝癌组出现细胞核大、深染,肝异型增生的癌变细胞。与肝癌组相比,5-FU组与IGBR组大鼠肝小叶结构基本存在,可见点状、灶状坏死,细胞核异型性较大,诱癌的三个阶段的病理变化明显改善。(4)TUNEL检测结果:与对照组相比,肝癌组大鼠肝脏肝细胞凋亡增加,细胞质呈棕黄色,凋亡的肝细胞皱缩、核固缩及核仁消失。与肝癌组相比,5-FU组与IGBR组细胞凋亡增多,差异有统计学意义(P0.05),IGBR组和5-FU组间无明显统计学差异(P0.05)。(5)免疫组化结果:磷蛋白53(p53)、Bcl-2、磷蛋白21(p21)和c-myc阳性细胞主要分布于不典型增生灶和癌灶中,表达于胞浆。与对照组相比,肝癌组p53、Bcl-2、p21和c-myc表达增多,差异均有统计学意义(P0.05);与肝癌组相比,5-FU组和IGBR组p53、p21表达增多,而Bcl-2和c-myc表达减少,差异有统计学意义(P0.05),IGBR组和5-FU组间无明显统计学差异(P0.05)。(6)Western Blot检测结果:与对照组相比,肝癌组p-ERK、p-Akt表达减少,p-JNK、p-p38表达增多,均有统计学差异(P0.05);ERK、p38、JNK、Akt表达无显明变化。与肝癌组相比,5-FU组与IGBR组p-ERK、p-Akt蛋白表达减少,p-JNK、p-p38蛋白表达增多,均有统计学差异(P0.05);IGBR组和5-FU组间无明显统计学差异(P0.05)。结论:1.IGBR含药血清能够抑制人肝癌SMMC-7721细胞的增殖。2.IGBR含药血清诱导人肝癌SMMC-7721细胞凋亡,且呈浓度依赖性。3.MAPK和PI3K/Akt信号传导通路参与调节IGBR含药血清诱导人肝癌SMMC-7721细胞凋亡。4.IGBR可通过提高肝组织抗氧化活性,保护DEN诱发肝癌大鼠肝脏。5.IGBR通过调节凋亡相关蛋白及肝癌相关信号传导通路蛋白的表达,诱导细胞凋亡,抑制DEN诱发大鼠肝癌细胞的生长。
【学位授予单位】：延边大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R285.5
【图文】：

含药血清,活力,细胞活力,人肝癌

逦延边大学博士学位论文第三章结果逡逑３．１ＩＧＢＲ含药血清对人肝癌细胞增殖的影响逡逑３．１．１邋ＩＧＢＲ含药血清对人肝癌ＳＭＭＣ－７７２１细胞增殖活力的影响逡逑５－ＦＵ含药血清和不同浓度ＩＧＢＲ含药血清作用于人肝癌ＳＭＭＣ－７７２１细２４邋ｈ后，细胞活力分另ＩＪ降低为７３．２邋％、８６．１％、８０．２邋％和７５．３％，与对照组相有统计学差异ＣＰ＜0．0５），邋５－ＦＵ组杀伤作用略强于ＩＧＢＲ组；继续作用至４８邋ｈ后细胞活力进一步降低为５６．２邋％、６８．３邋％、６１．１邋％和５８．２邋％，与对照组相比有统学差异（尸＜0．0５），５－ＦＵ组杀伤作用略强于ＩＧＢＲ组，见图３－１。实验结果说明ＩＧＢ含药血清可降低人肝癌ＳＭＭＣ－７７２１细胞活力，并呈浓度和时间依赖性。逡逑２４邋ｈ逡逑

含药血清,肝癌,HepG2细胞,活力

逦延边大学博士学位论文逦逡逑本实验还选用了两种人肝癌ＨｅｐＧ２和ＳＫ－Ｈｅｐｌ细胞，观察５－ＦＵ含药血清逡逑和ＩＧＢＲ含药血清对人肝癌细胞增殖的作用，进一步验证ＩＧＢＲ含药血清对肝癌逡逑细胞的抑制作用。检测结果显示：５－ＦＵ含药血清和ＩＧＢＲ含药血清可抑制人肝逡逑癌ＨｅｐＧ２和ＳＫ－Ｈｅｐｌ细胞增殖，并呈浓度和时间依赖性。如图３－２所示：５－ＦＵ逡逑含药血清和不同浓度ＩＧＢＲ含药血清作用人肝癌ＨｅｐＧ２和ＳＫ－Ｈｅｐ邋１细胞２４邋ｈ后，逡逑细胞活力分另丨Ｊ降低为邋７６．１％、８７．２邋％、８３．１邋％、７８．３邋％和邋７７．２邋％、８８．１邋％、８３＿３邋％、逡逑７９．２％，与对照组相比有统计学差异（Ｐ＜０．０５），５－ＦＵ组杀伤作用略强于ＩＧＢＲ组；逡逑作用４８邋ｈ后，细胞活力进一步降低为６４．１邋％、７７．１邋％、７２．３邋％、６６．２邋％和６８．１邋％、逡逑８１．２％、７６．２％、７０．１％，与对照组相比有统计学差异（Ｐ＜０．０５），邋５－ＦＬＪ组杀伤作逡逑用略强于ＩＧＢＲ组。逡逑２４邋ｈ逡逑

含药血清,细胞活力,肝癌,细胞坏死

３．２邋ＩＧＢＲ含药血清对人肝癌ＳＭＭＣ－７７２１细胞形态的影响逡逑５－ＦＵ含药血清和不同浓度ＩＧＢＲ含药血清干预４８邋ｈ后，倒置显微镜下观察逡逑人肝癌ＳＭＭＣ－７７２１细胞形态，结果如图３－３所示：对照组细胞完全贴壁、紧密逡逑相连、均匀透亮呈梭状；而５－ＦＵ含药血清和ＩＧＢＲ含药血清处理后细胞发生坏逡逑死、变性，体积缩小、数目减少，且细胞坏死程度随着ＩＧＢＲ给药剂量的增加逐逡逑渐加重，且贴壁不牢固，出现脱落现象。５－ＦＵ组细胞坏死程度比较严重，细胞逡逑数目较少，细胞稀疏较为明显。与５－ＦＵ组相比，ＩＧＢＲ组细胞坏死程度较低。逡逑１１逡逑

【参考文献】