蟾酥及其微生物转化产物通过激活AMPK蛋白诱导肿瘤细胞凋亡及线粒体功能改变的研究

发布时间：2020-07-30 21:31

【摘要】：蟾酥为蟾蜍科动物中华大蟾蜍或黑眶蟾蜍等蟾蜍的耳后腺及皮肤腺分泌的白色浆液经加工干燥制成的名贵中药材。蟾酥具有很高的药用价值,然而因毒副作用较大而限制了其应用。微生物转化作为运用于食品、药品等工业化的经典技术,其具有提高药性、减小毒性、增加适应症等特点。本文就蟾酥的微生物转化进行研究,揭示蟾酥微生物转化的特点及蟾酥抗肿瘤的作用机理。通过细胞水平及动物水平的研究,利用MTT法发现浓度为0.001-1.0 mg/ml蟾酥均能够有效抑制肺癌细胞A549的增殖,通过流式细胞术定性检测发现浓度为0.00001、0.005、0.01 mg/ml蟾酥能够诱导肺癌细胞A549的早期凋亡,而浓度为0.05、0.1 mg/ml蟾酥能够诱导肺癌细胞A549的晚期凋亡及坏死,且促凋亡蛋白Bax及Bad蛋白的表达均明显上调。透电镜下观察经蟾酥干预后的肺癌细胞A549明显呈不规则形态。利用移植瘤裸鼠造模及干预,发现第7周时蟾酥能有效抑制瘤体的生长。通过采集不同环境的土壤样本,加入10倍量的无菌水混匀,得到的土壤悬液用无菌水稀释100倍后在含浓度为0.5 mg/ml的蟾酥转化培养基上能较好地筛选出抗蟾酥毒性的菌株。根据菌落的形态、颜色、质地筛选得到150余株微生物菌种,编号为1-150。根据微生物对蟾酥的转化能力从中筛选出1株能充分转化蟾酥中成分为酯蟾毒配基的微生物菌株,编号为BV-77。对菌株BV-77 DNA进行提取并对16S r DNA进行扩增,测序。通过对BLAST比对以及系统发育树的分析,确定了其种属分类地位。菌株BV-77鉴定结果为:Bacillus marisflavi TF-11门(Firmicutes)、芽孢杆菌纲(Bacilli)、芽孢杆菌目(Bacillales)、芽孢杆菌属(Bacillus)。运用薄层层析法确定各个成分Rf值,其中酯蟾毒配基Rf值为0.81,华蟾酥毒基Rf值为0.71,蟾毒灵Rf值为0.62,蟾毒它灵Rf值为0.50,远华蟾毒精Rf值为0.42,沙蟾毒精Rf值为0.31。TLC法鉴别蟾酥及其转化产物的所含成分,发现菌株BV-77可以有效转化蟾酥中含量较高的酯蟾毒配基,生成产物远华蟾毒精。通过高效液相色谱法进行定性定量检测,HPLC条件为流动相为0.1%甲酸水(A)-乙腈(B),梯度洗脱(0-15 min:70%A→45%A;15-40 min:55%A),流速0.7 ml/min,柱温40℃,进样量10μl,检测波长296 nm,通过外标法计算出底物中酯蟾毒配基和远华蟾毒精的占比分别为11.63%、0.63%,转化产物中酯蟾毒配基和远华蟾毒精的占比分别为0.13%、11.29%,且该体系转化效率达到82.20%。比较蟾酥及转化产物两者对肺癌细胞A549的抗肿瘤效果。通过MTT法发现0.001-1.0 mg/ml转化产物的增殖抑制效果均优于底物蟾酥,且0.001-0.1 mg/ml转化产物较同浓度的底物蟾酥对正常细胞的毒性有所减小。利用流式细胞术发现0.1 mg/ml及0.5 mg/ml转化产物较蟾酥更能够促使细胞内产生大量ROS。利用蛋白免疫印记技术发现转化产物能够诱导促凋亡蛋白Bad及Bax高表达,且效果优于底物蟾酥。结合分子生物学方法,探索蟾酥及转化产物抑制肿瘤的分子机制。发现了两者激活能量代谢调控中心AMPK并在糖酵解水平及线粒体功能两大方面具有显著的影响。其通过抑制糖酵解通路关键限速蛋白HK2、PKM2的表达、降低P-PFK-2/PFK-2酵解速率及损伤线粒体结构、改变线粒体功能,上调线粒体分蛋白Drp1及自噬蛋白Beclin的的表达来达到对肺癌细胞A549的杀伤作用。
【学位授予单位】：上海师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R285.5
【图文】：

蟾蜍,母核,蟾酥,结构表

蟾蜍内酯类化合物根母核结构

蟾酥,肺癌细胞

图 2-1 不同浓度蟾酥对肺癌细胞 A549 增殖抑制率1 Inhibition rate of lung cancer cell A549 by Venenum bufonis at different concentrati*,p<0.05; **, p<0.01，***, p<0.001，n=5

蟾酥,荧光,强度

图 2-2 不同浓度蟾酥对 Annexin V 染色的荧光偏移强度ig.2-2 Fluorescence migration intensity ofAnnexin V staining with Venenum bufonisdifferent concentrations

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