TRPM3在葛根素促成骨细胞增殖、分化和矿化中的作用
发布时间：2020-07-31 20:37
【摘要】：目的:研究葛根素对小鼠MC3T3-E1成骨细胞增殖、分化和矿化的影响以及TRPM3在其中的作用,为临床应用葛根素治疗骨质疏松以及葛根素在临床上的进一步开发利用提供理论指导。方法:1.不同浓度(0.1,1,10μM)的葛根素作用于成骨细胞24,48和72h后,CCK-8法检测空白对照组、葛根素组以及阳性对照雌二醇组细胞的活性。2.0.1,1,10μM葛根素作用成骨细胞48h后,流式细胞术检测空白对照组、葛根素组以及雌二醇组细胞的细胞周期。3.碱性磷酸酶(ALP)活性检测0.1μM葛根素和0.01μM雌二醇作用48h后成骨细胞分化能力的改变。4.茜素红钙结节染色法检测0.1μM葛根素和0.01μM雌二醇干预14,21和28d后各组细胞的矿化能力。5.RT-PCR和Western Blotting检测0.1 μM葛根素和0.01μM雌二醇作用细胞48h后,TRPM3mRNA和蛋白质的表达水平。6.流式细胞术和钙离子检测试剂盒分别检测0.1μM葛根素作用2,24和48h后,细胞内、外钙离子的浓度。7.转染TRPM3-siRNA、使用TRPM3激动剂孕烯醇酮硫酸盐(pregnenolone sulfate,PS)、TRPM3抑制剂2-氨基乙酯二苯基硼酸(2-aminoethoxydiphenyl borate,2-APB)作用 MC3T3-E1 细胞后,检测 Runx2表达水平以及成骨细胞增殖、分化和矿化能力的改变。结果:1.0.1,1,10μM葛根素能显著促进小鼠MC3T3-E1成骨细胞增殖,使G1期细胞比例减少,G2+S期细胞比例增加,其中以0.1μM的浓度作用效果最佳。与空白对照组相比较,0.1μM葛根素能显著提高细胞ALP活性,促进矿化结节的形成。2.0.1μM葛根素作用细胞48h后,TRPM3表达水平降低,而Runx2的表达水平升高。3.TRPM3-siRNA和2-APB作用细胞48h后能够促进Runx2的表达,从而促进成骨细胞增殖分化,而PS则抑制此作用。4.向细胞培养液中加入不同浓度(0.5,5,10,20mM)的钙离子,分别培养24,36和48h,与空白对照组相比较,钙离子组的细胞活性和ALP活性显著增强。5.葛根素作用细胞2h后,细胞内的钙离子浓度增加,细胞外钙离子浓度减少;作用24h时,与空白对照组相比较,葛根素组细胞内、外钙离子浓度的差异没有统计学意义。当作用时间延长至48h时,表现为葛根素组细胞内钙离子浓度降低,细胞外钙离子浓度升高。结论:葛根素能够促进小鼠MC3T3-E1成骨细胞增殖,分化和矿化,原因可能为:①葛根素通过下调TRPM3表达导致Runx2的表达增强,从而促进成骨细胞增殖和分化;②葛根素短时间(2h)内能使细胞内的钙离子浓度增加,细胞外钙离子浓度减少,促进细胞的增殖和分化;长时间(48h)作用后,TRPM3的表达量下降,使渗透到细胞内的钙离子减少,导致细胞外间隙的钙离子浓度增加,这可能是为了增加与细胞外基质蛋白的结合,为矿化做准备。
【学位授予单位】：南京中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R285.5
【图文】：
图１：葛根素对ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１细胞增殖，分化和矿化的影响逡逑：用不同浓度（０．１，１，１0ｍＭ）的葛根素处理ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１细胞２４，邋４８和７２小时，逡逑ＣＫ－８法测定评估细胞增殖能力。Ｂ：邋０．１邋ｐＭ葛根素处理４８小时后检测细胞的碱逡逑磷酸酶（ＡＬＰ）水平。Ｃ：光学显微镜下矿化结节的茜素红染色（ｘｌＯＯ）。Ｄ：逡逑．ｌ＾ｉＭ葛根素处理细胞１４，邋２１和２８天后，检测各组相对矿化结节面积。Ｅ：邋０．１，逡逑
ｍｉＲ－２０４与ＴＲＰＭ３的ｍＲＮＡ共同表达我们的前期实验研究发现葛根素能够逡逑下调ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１细胞中ｍｉＲ－２０４的表达，葛根素对ＴＲＰＭ３表达的影响也值得进一逡逑步探讨。如图２Ａ实验结果所示，作用４８ｈ后，与空白对照组相比较，Ｏ．ｌ＾Ｍ葛根逡逑素组和Ｏ．Ｏｌ＾Ｍ雌激素组细胞ＴＲＰＭ３邋ｍＲＮＡ表达水平显著下降。图２Ｂ和图２Ｃ的逡逑Ｗｅｓｔｅｒｎ邋Ｂｌｏｔｔｉｎｇ结果显示，葛根素组和雌激素组的ＴＲＰＭ３蛋白表达量也明显降逡逑低。结果表明，葛根素不仅能下调ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１细胞中ｍｉＲ－２０４的表达，也能降低逡逑ＴＲＰＭ３的ｍＲＮＡ和蛋白质表达量。逡逑Ａ逦Ｂ逡逑０逦１－５＇逡逑＾逦Ｃｏｎｔｒｏｌ邋Ｐｕｅ邋Ｅ２逡逑Ｚ邋“逦｜逡逑１邋１０＊邋￣￣｜逦ＴＲＰＭ３邋逦逦逦邋１９７ＫＤ逡逑§逦－ｊ－逡逑隹邋0．５－逦＊逦（３－ａｃｔｉｎ逦４３ＫＤ逡逑ｏ．ｏ逦￣逡逑Ｃｏｎｔｒｏｌ邋Ｐｕｅ逦Ｅ２逡逑Ｃ＿逡逑１邋１．５－，逡逑０逡逑１逡逑２逦ｔｏ－邋ｒ逡逑卜ｉ？逡逑圣邋0．0」逦逦■■■￣■■■Ｌ逡逑Ｃｏｎｔｒｏｌ逦Ｐｕｅ逦Ｅ２逡逑图２：葛根素对ＴＲＰＭ３表达的影响逡逑Ａ：邋Ｏ．ｌｐＭ葛根素作用细胞４８小时后，ＲＴ－ＰＣＲ法检测ＴＲＰＭ３邋ｍＲＮＡ的表达。Ｂ－Ｃ：逡逑０．１｜＿ｉＭ葛根素作用细胞４８小时后，Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔｔｉｎｇ法检测ＴＲＰＭ３蛋白的表达量。逡逑＜０．０５，与空白对照组相比较。逡逑２．３邋ＴＲＰＭ３抑制ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１细胞Ｒｕｎｘ２的表达逡逑Ｒｕｎｘ２是一种关键的骨生长调节因子，参与了成骨细胞的X椫澈头只Ｎ颐清义锨捌谑笛檠芯糠⑾
本文编号：2776978
【学位授予单位】：南京中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R285.5
【图文】：
图１：葛根素对ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１细胞增殖，分化和矿化的影响逡逑：用不同浓度（０．１，１，１0ｍＭ）的葛根素处理ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１细胞２４，邋４８和７２小时，逡逑ＣＫ－８法测定评估细胞增殖能力。Ｂ：邋０．１邋ｐＭ葛根素处理４８小时后检测细胞的碱逡逑磷酸酶（ＡＬＰ）水平。Ｃ：光学显微镜下矿化结节的茜素红染色（ｘｌＯＯ）。Ｄ：逡逑．ｌ＾ｉＭ葛根素处理细胞１４，邋２１和２８天后，检测各组相对矿化结节面积。Ｅ：邋０．１，逡逑
ｍｉＲ－２０４与ＴＲＰＭ３的ｍＲＮＡ共同表达我们的前期实验研究发现葛根素能够逡逑下调ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１细胞中ｍｉＲ－２０４的表达，葛根素对ＴＲＰＭ３表达的影响也值得进一逡逑步探讨。如图２Ａ实验结果所示，作用４８ｈ后，与空白对照组相比较，Ｏ．ｌ＾Ｍ葛根逡逑素组和Ｏ．Ｏｌ＾Ｍ雌激素组细胞ＴＲＰＭ３邋ｍＲＮＡ表达水平显著下降。图２Ｂ和图２Ｃ的逡逑Ｗｅｓｔｅｒｎ邋Ｂｌｏｔｔｉｎｇ结果显示，葛根素组和雌激素组的ＴＲＰＭ３蛋白表达量也明显降逡逑低。结果表明，葛根素不仅能下调ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１细胞中ｍｉＲ－２０４的表达，也能降低逡逑ＴＲＰＭ３的ｍＲＮＡ和蛋白质表达量。逡逑Ａ逦Ｂ逡逑０逦１－５＇逡逑＾逦Ｃｏｎｔｒｏｌ邋Ｐｕｅ邋Ｅ２逡逑Ｚ邋“逦｜逡逑１邋１０＊邋￣￣｜逦ＴＲＰＭ３邋逦逦逦邋１９７ＫＤ逡逑§逦－ｊ－逡逑隹邋0．５－逦＊逦（３－ａｃｔｉｎ逦４３ＫＤ逡逑ｏ．ｏ逦￣逡逑Ｃｏｎｔｒｏｌ邋Ｐｕｅ逦Ｅ２逡逑Ｃ＿逡逑１邋１．５－，逡逑０逡逑１逡逑２逦ｔｏ－邋ｒ逡逑卜ｉ？逡逑圣邋0．0」逦逦■■■￣■■■Ｌ逡逑Ｃｏｎｔｒｏｌ逦Ｐｕｅ逦Ｅ２逡逑图２：葛根素对ＴＲＰＭ３表达的影响逡逑Ａ：邋Ｏ．ｌｐＭ葛根素作用细胞４８小时后，ＲＴ－ＰＣＲ法检测ＴＲＰＭ３邋ｍＲＮＡ的表达。Ｂ－Ｃ：逡逑０．１｜＿ｉＭ葛根素作用细胞４８小时后，Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔｔｉｎｇ法检测ＴＲＰＭ３蛋白的表达量。逡逑＜０．０５，与空白对照组相比较。逡逑２．３邋ＴＲＰＭ３抑制ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１细胞Ｒｕｎｘ２的表达逡逑Ｒｕｎｘ２是一种关键的骨生长调节因子，参与了成骨细胞的X椫澈头只Ｎ颐清义锨捌谑笛檠芯糠⑾
本文编号：2776978
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