金银花石油醚部位抗特发性肺纤维化的药效活性与作用机制研究

发布时间：2020-08-06 11:53

【摘要】：目的:探究中药金银花石油醚部位抗特发性肺纤维化疾病的药效活性及作用机制,并对其可能药效化学成分进行初步预测。通过建立体外细胞模型对金银花石油醚部位进行药效探究和机制分析,在此基础上利用体内动物模型对体外筛选结论进行验证,进一步确定药效。同时利用GC-MS和LC-MS技术分析金银花石油醚部位化学成分,对其可能药效成分进行初步预测。方法:1、体外实验:基于本实验室已经验证并使用的体外TGF-β1诱导的A549上皮间质转化细胞模型为基础,采用RT-PCR法检测胶原蛋白Ⅰ(Col I)以及上皮间质转化(Eepithelial-to-mesenchymal transition,EMT)过程相关基因:E-钙黏蛋白(E-cadherin)基因、波形蛋白(Vimentin)基因、平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的基因表达情况;采用ELISA检测细胞上清液中羟脯氨酸(HYP)含量变化,对金银花石油醚部位治疗特发性肺纤维化体外药效及作用机制进行初步探究。2、体内实验:以博莱霉素(bleomycin,BLM)诱导的C57BL/6小鼠IPF模型为基础,通过对小鼠肺组织石蜡切片,进行HE、Masson染色观察肺部病理状况;ELISA检测小鼠肺组织中HYP的表达情况;采用RT-PCR法检测肺组织匀浆中胶原蛋白Ⅰ(Col I)以及EMT过程中的标志基因E-cadherin、Vimentin、α-SMA的表达情况。进而对体外细胞实验结果进行体内验证。3、金银花石油醚部位成分进行GC-MS和LC-MS定性分析,对其可能药效成分进行初步预测。结果:1、体外实验:形态学观察结果显示金银花石油醚部位可有效抑制TGF-β1诱导A549细胞发生上皮间质转化,使纤维样细胞向正常上皮细胞样转变;RT-PCR结果表明金银花石油醚加药组相比于TGF-β1诱导的模型组E-cadherin mRNA表达上调,Col I、α-SMA、Vimentin mRNA表达下调;ELISA结果显示加药组相对模型组羟脯氨酸含量降低。2、体内实验:HE和Masson染色结果显示假手术组肺组织结构清晰,无出血点,胶原沉积量少,模型组肺壁明显增厚,肺间隔明显变小,实质性病变呈现片状,胶原沉积明显,金银花石油醚部位组肺泡壁略微增厚,肺泡间隔明晰,实质性病变减少,未见明显胶原沉积,与模型组相比有所好转。ELISA检测结果显示金银花石油醚部位加药组的肺组织匀浆中羟脯氨酸的含量明显低于模型组,RT-PCR结果表明肺组织匀浆中E-cadherin mRNA表达上调,Col I、α-SMA、Vimentin mRNA基因表达下调。3、采用GC-MS技术结合数据库检索对金银花药效部位进行定性分析共鉴定出22种化合物,主要为脂肪酸类、脂类、甾醇类和醛类。4、采用UPLC-Q-Extractive/MS技术对金银花药效部位进行定性分析,总共鉴定以新绿原酸、绿原酸、咖啡酸等酚酸类成分为主的14种化学成分。结论:金银花石油醚部位可有效抑制转化生长因子TGF-β1诱导的A549细胞细胞外基质重要组成蛋白Col I的基因表达,减少该胶原蛋白主要氨基酸成分羟脯氨酸分泌,证明在体外实验中,金银花石油醚部位具有抗特发性肺纤维化的药效活性。在此基础上,采用RT-PCR技术从基因水平对上皮间质转化过程中的标志性蛋白α-SMA、Vimentin、E-cadherin含量变化进行探究,结果显示金银花石油醚部位对EMT过程有抑制作用,证明金银花抗特发性肺纤维化的体外活性作用机制可能与抑制上皮间质转化有关。在此基础上,采用博莱霉素诱导的体内肺纤维化动物模型对其治疗药效进行进一步验证。从HE、MASSON以及ELISA结果均可看出,金银花石油醚部位对博莱霉素诱导的肺纤维化小鼠有潜在治疗作用。此外,RT-PCR结果也显示该部位作用机制可能是通过抑制上皮细胞发生EMT过程实现的。GC-MS和LC-MS分析发现,金银花石油醚部位主要成分为脂肪酸类、脂类、甾醇类、醛类,以及酚酸类成分,从而提示此类成分及其组合有可能是抗特发性肺纤维化的潜在活性物质。综上所述,金银花石油醚部位抗特发性肺纤维化的作用机制可能是通过调控上皮间质转化的标志性基因(Vimentin、α-SMA、E-cadherin)实现的。本研究为抗肺纤维化新药研发提供重要的实验基础。
【学位授予单位】：山东中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R285.5
【图文】：

生长抑制作用,金银花,石油醚,部位

金银花石油醚部位对A549细胞的生长抑制作用（X±s,n=3）

金银花,石油醚,部位

注：1.空白对照组；2.模型组；3.金银花石油醚 2.5 μg·mL-1组；4.金银花石油醚 5 μg·mL-1组；5.金银花石油醚 10 μg·mL-1组。图 2-1 不同剂量金银花石油醚部位对 TGF-β诱导的 A549 细胞形态学影响（200×）3.2 金银花石油醚部位对A549细胞内ColⅠ、E-cadherin、Vimentin、α-SMAmRNA的表达水平的影响采用 RT-PCR 法检测不同浓度金银花石油醚部位对 A549 细胞中 ColⅠ、α-SMA、Vimentin 和 E-cadherin mRNA 基因表达的影响，结果显示，与对照组相比较，模型组 ColⅠ、α-SMA 和 VimentinmRNA 明显升高（P＜0.05），E-cadherin mRNA 明显降低（P＜0.01）。与模型组相比较，加药低剂量组 ColⅠmRNA（P＜0.01），α-SMA、Vimentin mRNA 降低，E-cadherin mRNA 升高；加药中剂量组 ColⅠmRNA（P＜0.01），α-SMA、Vimentin mRNA 降低（P＜0.05），E-cadherin mRNA 升高（P＜0.01）；加药高剂量组 ColⅠ、Vimentin mRNA（P＜0.01），α-SMAmRNA 降低（P＜0.05），

金银花,石油醚,部位,低剂量

金银花石油醚部位对 A549 细胞内 E-cadherin、Vimentin 、α-SMA、ColⅠ mRNA 表达的影响( X ±s, n=3)E-cadherin (%) Vimentin(%) α-SMA (%) ColⅠ (%)对照组 100 100 100 100模型组 42.49±16.532）175.69±38.081）142.76±8.222）5695.27±691.262）低剂量组 54.23±9.33 152.00±4.4 132.09±2.5194）4837.39±350.193）中剂量组 195.00±8.794）122.89±12.294）112.61±4.954）3706.98±403.044）高剂量组 114.00±13.234）109.419±20.244）103.87±2.874）3100.07±457.644）注：与空白对照组比较1）P㩳0.05，2）P㩳0.01；与模型组比较3）P㩳0.05，4）P<0.01。

【参考文献】