中药水蛭抗动脉粥样硬化及调脂机制研究

发布时间：2020-08-09 11:34

【摘要】：目的动脉粥样硬化(Atherosclerosis,AS)是一种慢性进行性炎症疾病,疾病的发生涉及多种发病机制;其中,血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)的激活、迁移与增殖是AS发生的重要病理过程,有研究指出VSMCs增殖与凋亡的失衡是AS发生过程中斑块形成的重要环节,而高脂血症是AS发生发展的危险因素。前期研究已证实中药水蛭对早期AS大鼠VSMCs的增殖及表型转化具有一定的抑制作用,同时能够调降血脂,但尚不清楚具体作用机制。p38MAPK信号转导通路是一条可调控细胞增殖与死亡的重要通路,可参与细胞增殖、分化和凋亡等多种生理过程;ACAT-2、Fas、HMGCR为肝脏中参与调节脂质代谢及合成过程相关的酶。本研究通过观察中药水蛭对早期AS大鼠的影响,旨在探索p38MAPK信号转导通路在AS发生发展过程中对大鼠VSMCs增殖与凋亡的调控作用,观察中药水蛭干预过程中大鼠血脂的动态变化,探讨中药水蛭抗动脉粥样硬化以及调降AS大鼠血脂的机制。方法1.建立动物模型:采用高脂饲料(High fat diet,HFD)喂养联合腹腔注射维生素D_3的方式建立早期AS大鼠模型。40只健康雄性Wistar大鼠适应性喂养1周后,采用数字随机表法将大鼠分为4组:正常对照组,模型组,水蛭低(0.6g·kg~(-1))、高(1.2 g·kg~(-1))剂量组,每组各10只。分组完成后称量大鼠体重,随即对模型组,水蛭低、高剂量组大鼠给予一次性腹腔注射维生素D_3注射液60万IU·kg~(-1),同时给予HFD喂养;对正常对照组大鼠给予腹腔注射等量生理盐水,同时给予普通饲料喂养。2.中药水蛭干预:腹腔注射完成后第2天,将配好的中药水蛭药液按照剂量分别对两水蛭干预组进行灌胃干预(10mL·kg~(-1)),同时对正常对照组和模型组给予等量蒸馏水灌胃,每天1次,连续灌胃8周。每周末称大鼠体重1次以调整灌胃量。3.标本收集及检测:于实验初及第4周末对各组大鼠尾静脉取血检测血脂水平;第8周实验结束时,处死大鼠留取所需组织,同时依据体重计算大鼠肝脏指数;生化分析仪检测大鼠血清中TG、TC、LDL-C、HDL-C的水平;使用ELISA法测定大鼠TGF-β1的水平;免疫组织化学法(Immunological Histological Chemitry,IHC)检测VSMCs中PCNA、Caspase-3表达;TUNEL法检测大鼠VSMCs凋亡水平;Western blot检测VSMCs中MKK3、P38及C-myc蛋白的表达和肝脏组织中ACAT-2、Fas、HMGCR的表达水平;光镜下观察大鼠主动脉弓苏木素-伊红(HE)染色后的病理改变;大鼠肝脏组织油红O染色后观察肝脏脂质沉积情况。结果1.大鼠体重、肝脏指数的改变:实验开始时,各组大鼠体重无明显差异(P0.05);随着实验的进程,正常对照组大鼠体重呈现稳步增长趋势,模型组大鼠体重增长稍缓慢,体重低于正常对照组(P0.01);两水蛭干预组大鼠体重增长较平稳,体重高于模型组(P0.01),两水蛭干预组之间体重无明显差异。模型组大鼠的肝脏质量及肝脏指数明显高于对照组,差异具有统计学意义(P0.01);水蛭干预组大鼠的肝脏质量及肝脏指数较模型组大鼠低,差异具有统计学意义(P0.01)。2.大鼠血清血脂水平的变化:实验初,各组大鼠TG、TC、LDL-C、HDL-C差异不明显(P0.05);随着实验的进行直至结束,各组大鼠TG水平差异不明显(P0.05);第4、8周时,与正常对照组比较,模型组TC和LDL-C水平显著升高,HDL-C逐渐降低,差异有统计学意义(P0.01);与模型组比较,水蛭高低剂量组TC和LDL-C水平明显降低,差异具有统计学意义(P0.01),水蛭低剂量组较高剂量组有所降低,但差异无统计学意义(P0.05);水蛭高低剂量组较模型组HDL-C有升高趋势,但两组间HDL-C水平在实验期间无明显差异(P0.05)。3.血清TGF-β1表达水平的变化:模型组TGF-β1较正常对照组明显升高,差异有统计学意义(P0.01);水蛭各干预组TGF-β1明显较模型组降低,差异均具有统计学意义(P0.01);两水蛭干预组组间差异无统计学意义(P0.05)。4.大鼠VSMCs中MKK3、P38及C-myc蛋白表达的改变:与正常对照组相比较,模型组的P38和C-myc蛋白表达增加,差异具有统计学意义(P0.01),MKK3表达水平差异不明显,无统计学意义(P0.05);水蛭各干预组的MKK3、P38、C-myc蛋白表达明显较模型组降低,差异具有统计学意义(P0.01);与水蛭低剂量组比较,水蛭高剂量组的MKK3及C-myc蛋白表达轻度增加,差异具有统计学意义(P0.05),P38表达水平差异不具有统计学意义(P0.05)。5.大鼠肝脏组织中ACAT-2、Fas、HMGCR的表达水平:与正常对照组比较,模型组大鼠肝脏的ACAT-2、Fas及HMGCR水平明显升高,差异具有统计学意义(P0.01);与模型组比较,水蛭高低剂量组大鼠肝脏ACAT-2、Fas及HMGCR水平明显降低,差异具有统计学意义(P0.01),同时,水蛭高剂量组大鼠肝脏HMGCR水平较水蛭低剂量组有降低趋势(P0.05),两者的ACAT-2、Fas水平无明显差异(P0.05)。6.大鼠VSMCs中PCNA、Caspase-3表达的变化:模型组的PCNA较正常对照组明显升高,差异有统计学意义(P0.01),Caspase-3轻度升高,但差异无统计学意义(P0.05);水蛭各干预组PCNA较模型组明显降低,Caspase-3明显升高,差异均具有统计学意义(P0.01);与水蛭低剂量组相比,水蛭高剂量组PCNA有所升高,Caspase-3有所较降低,但差异无统计学意义(P0.05)。7.大鼠VSMCs凋亡率的比较:与正常对照组相比较,模型组大鼠VSMCs凋亡阳性细胞百分比无明显差异(P0.05),表明正常对照组与模型对照组之间大鼠VSMCs凋亡率差异不明显;与模型组相比,中药水蛭各干预组大鼠VSMCs凋亡阳性细胞百分比明显升高(P0.01),表明中药水蛭干预组大鼠VSMCs凋亡率较模型组高。8.大鼠血清TGF-β1的表达水平与Caspase-3及VSMCs的凋亡率呈负相关(r分别为-0.412与-0.394),与MKK3、PCNA、P38、C-myc、ACAT-2、Fas及HMGCR的表达水平呈正相关(r分别为0.434,0.774,0.656,0.661,0.725,0.791,0.870),差异均具有统计学意义(P0.05)。9.主动脉形态学改变:光镜下观察胸主动脉HE染色切片(200倍视野),可见正常对照组大鼠主动脉内膜完整、光滑,VSMCs排列整齐,未见明显胆固醇结晶沉积及斑块形成;模型组主动脉内膜不平整,可见明显向腔内凸起的斑块,内、中膜明显增厚,VSMCs增生、排列紊乱,可见胆固醇结晶沉积,明显斑块形成;水蛭各干预组主动脉病理改变较模型组均有不同程度减轻,可见水蛭低剂量组主动脉内中膜增厚较轻,内膜下少量斑块形成,斑块内有少量胆固醇结晶,VSMCs排列较整齐,水蛭高剂量组可见少量斑块及胆固醇结晶沉积,VSMCs排列较为整齐,斑块较少。10.大鼠肝脏肉眼及油红O染色观察:正常对照组大鼠肝脏表面光滑,色泽红润,边缘较锐,呈现红褐色,质地较韧;模型组大鼠肝脏弥漫肿大感,表面光滑,边缘钝厚,呈苍白色,质软颗粒感,伴油腻感;水蛭低剂量组大鼠肝脏颜色呈淡红褐色,边缘稍钝,质软,与模型组比较,体积稍小,颗粒感、油腻感轻;水蛭高剂量组大鼠肝脏颜色稍苍白,边缘稍钝,质软,与模型组比较,体积稍小,颗粒感、油腻感轻,但肝脏颗粒感、油腻感较水蛭低剂量组明显。正常对照组大鼠肝脏未见明显脂滴沉积,模型组大鼠肝脏可见明显脂滴沉积,呈弥漫性;与模型组比较,水蛭高低剂量组大鼠肝脏脂滴沉积减少,但水蛭高剂量组大鼠肝脏脂滴沉积较水蛭低剂量组明显。结论研究结果表明中药水蛭可干预AS的发生进程,可能的机制为:1.中药水蛭可降低早期AS大鼠的血清TC及LDL-C的水平,同时可使血清中HDL-C的水平升高,进而减少大鼠血管内膜上的脂质沉积;2.经过中药水蛭的干预,大鼠肝脏指数明显降低,影响大鼠肝脏中与脂质代谢有关的酶ACAT-2、Fas及HMGCR的表达来调降血脂;3.中药水蛭可降低大鼠血清TGF-β1的表达以降低VSMCs的增殖;4.中药水蛭可降低PCNA的表达以抑制VSMCs的增殖,上调Caspase-3的表达而促进VSMCs的凋亡;5.中药水蛭可调降p38MAPK信号通路蛋白MKK3、P38及C-myc蛋白的表达水平,调控VSMCs的增殖与凋亡来影响AS进程。
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R285.5
【图文】：

大鼠,凋亡,水蛭,低剂量

表 5 各组大鼠 VSMCs 凋亡率比较Table 5 The apoptosis rate of VSMCs in rats（ x ±s, n =组别剂量/（g kg-1）阳性细胞百分比（正常对照组 - 2.10±0.64模型组 - 2.45±0.911)水蛭低剂量组 0.6 7.01±0.752)水蛭高剂量组 1.2 7.15±0.602)注：与正常对照组相比，1)P >0.05；与模型对照组相比,2)P <0.01a.正常对照组 b.模型组

免疫组化染色,大鼠,水蛭,低剂量

6 The average optical density value of PCNAand Caspase-3of rats （ x ±s, n =7）组别剂量/（g kg-1） PCNA Caspase-3正常对照组 - 0.115±0.017 0.171±0.030模型组 - 0.238±0.0361)0.187±0.018水蛭低剂量组 0.6 0.129±0.0342)0.293±0.0302水蛭高剂量组 1.2 0.137±0.0372)0.274±0.0402注：与正常对照组相比，1)P <0.01；与模型对照组相比,2)P <0.01a.正常对照组 b.模型组

免疫组化染色,大鼠,水蛭

c.水蛭低剂量组 d.水蛭高剂量组 3 各组大鼠 VSMCs 的 Caspase-3 免疫组化染色（SABC，×400）g.3 The Caspase-3 immunohistochemical staining in VSMCs of rats（SABC，×40注：细胞胞浆显棕黄色为 Caspase-3 阳性染色。关蛋白 Western blot 检测大鼠血管平滑肌细胞 MKK3、P38 及 C-myc 蛋白表达水平与正常对照组相比较，模型组的 P38 和 C-myc 蛋白表达增加，差异意义（P <0.01），MKK3 表达水平差异不明显，无统计学意义（P >干预组的 MKK3、p38、C-myc 蛋白表达明显较模型对照组降低，差学意义（P <0.01）；与水蛭低剂量组比较，水蛭高剂量组的 MKK3 及达轻度增加，差异具有统计学意义（P <0.05），P38 表达水平差异不统计学意义（P >0.05）,见表 7，图 4。

【参考文献】