哈蟆油多不饱和脂肪酸累积途径及固体分散体制剂的制备工艺研究

发布时间：2020-08-13 19:41

【摘要】：目的:采集不同地点和不同时期的中国林蛙,确定中国林蛙哈蟆油中多不饱和脂肪酸的组成及含量变化规律;对哈蟆油进行转录组测序,得到哈蟆油多不饱和脂肪酸合成途径,并找到关键酶基因;对哈蟆油进行实时荧光定量测定,探讨哈蟆油不同时期的表达量,从而获得高质量的哈蟆油;进一步将获得的高质量哈蟆油采用固体分散体技术制备成剂型,并建立制剂质量标准,对制剂的稳定性和急性毒性进行研究,并进行剂型的免疫实验验证。方法:采集不同地点和不同时期的中国林蛙样品,取中国林蛙的输卵管,-80.0℃冰箱备存,提取哈蟆油中多不饱和脂肪酸并甲酯化,采用气相色谱法测定其多不饱和脂肪酸的含量,采用美国StatView软件分析多不饱和脂肪酸的组成及相对含量;并分析多不饱和脂肪酸的变化规律,探究哈蟆油质量最好的区域和最佳的采集时期。为了确定哈蟆油多不饱和脂肪酸累积途径,对哈蟆油进行转录组测序,生成数据库,并进行分析和统计,获得哈蟆油多不饱和脂肪酸合成途径及影响哈蟆油中多不饱和脂肪酸的关键酶基因。采用Trizol法提取哈蟆油中的RNA,使用Nanodrop 2000超微量紫外/可见光分光光度计对RNA浓度和质量进行检测,采用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的完整性;采用Takara公司的试剂盒将哈蟆油中的总RNA反转录为cDNA。采用实时荧光定量PCR检测脂肪酸脱氢酶基因在哈蟆油不同时期中的表达量,与测定各时期哈蟆油中多不饱和脂肪酸的含量相比较,获得高质量的哈蟆油,进一步将获得的高质量哈蟆油采用固体分散体技术制备成剂型,并建立最佳剂型的质量标准,进行稳定性、急性毒性研究,并采用小鼠动物实验进行哈蟆油最佳制剂的免疫实验验证。结果:采用气相色谱法测定中国林蛙不同地点和不同时期中哈蟆油多不饱和脂肪酸含量,结果发现中国吉林省靖宇县三道湖镇浆源中国林蛙养殖厂基地的哈蟆油中多不饱和脂肪酸含量最高,并且发现哈蟆油中的多不饱和脂肪酸含量在散居冬眠期(11~12月)时达到最高。通过对哈蟆油转录组测序结果分析,找到哈蟆油多不饱和脂肪酸的合成途径及影响哈蟆油中多不饱和脂肪酸含量的脂肪酸脱氢酶基因。采用实时荧光定量PCR测定哈蟆油不同时期的表达量,发现在散居冬眠期(11~12月)时表达量最高。采用固体分散体技术将获得的高质量哈蟆油制备成滴丸剂,基质为聚乙二醇4000,药物与聚乙二醇4000的比例为1:3,冷凝液为甲基硅油(100mm~2/s):轻质液状石蜡(1:1),药物与基质熔融温度为70℃。建立哈蟆油滴丸质量标准,符合2015版《中国药典》标准,稳定性试验符合要求。证明哈蟆油滴丸属实际无毒级。经口给予小鼠不同剂量的哈蟆油滴丸30天,能增强小鼠迟发型变态反应,说明哈蟆油滴丸能增强细胞免疫功能;并且试验结果表明能提高小鼠单核 巨噬细胞的碳廓清能力,说明哈蟆油滴丸能增强单核-巨噬细胞功能。结论:哈蟆油中的多不饱和脂肪酸含量在中国林蛙散居冬眠期(11~12月)时最高,与实时荧光定量PCR测定哈蟆油不同时期的表达量结果相符,并确定哈蟆油多不饱和脂肪酸生物合成的途径,找到关键酶基因;将获得的高质量哈蟆油采用固体分散体技术制备成滴丸剂,质量标准符合2015版《中国药典》规定,免疫试验证明哈蟆油滴丸能提高免疫力。
【学位授予单位】：长春中医药大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R283.6
【图文】：

3.1 考察气相色谱仪器在气相色谱条件各个参数相同的情况下，我们考察了岛津 GC2014（C）气相色谱仪和安捷伦 GC7890b 气相色谱仪，结果见图1和图2。图1 岛津 GC2014（C）气相色谱仪的气相色谱图图2 安捷伦GC7890b气相色谱仪的气相色谱图结果表明，使用岛津 GC2014（C）气相色谱仪进行考察时，发现气相色谱基线不平，更改使用安捷伦 GC7890b 气相色谱仪时，气相色谱基线漂移情况好转。所以本试验采用安捷伦 GC7890b 气相色谱仪进行试验。3.2 气相色谱柱的老化在做气相色谱仪器试验时，新的气相色谱毛细管柱子都需要进行老化，目的是使

3.1 考察气相色谱仪器在气相色谱条件各个参数相同的情况下，我们考察了岛津 GC2014（C）气相色谱仪和安捷伦 GC7890b 气相色谱仪，结果见图1和图2。图1 岛津 GC2014（C）气相色谱仪的气相色谱图图2 安捷伦GC7890b气相色谱仪的气相色谱图结果表明，使用岛津 GC2014（C）气相色谱仪进行考察时，发现气相色谱基线不平，更改使用安捷伦 GC7890b 气相色谱仪时，气相色谱基线漂移情况好转。所以本试验采用安捷伦 GC7890b 气相色谱仪进行试验。3.2 气相色谱柱的老化在做气相色谱仪器试验时，新的气相色谱毛细管柱子都需要进行老化，目的是使

Hp-88和Supelco公司的SPTM-2560气相色谱柱，结果见图3和图4。图3 安捷伦公司的Hp-88色谱柱气相色谱图图4 Supelco公司的SPTM-2560色谱柱气相色谱图试验说明，使用安捷伦Hp-88气相色谱柱进行试验时，三十七种脂肪酸混标最多能分离出三十六种，使用Supelco公司的SPTM-2560气相色谱柱进行试验时，三十七种脂

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