中药木蝴蝶总黄酮抗肝肿瘤活性及作用机制研究

发布时间：2020-08-15 21:38

【摘要】：目的本研究是国家自然科学基金项目“基于微流控细胞生物芯片技术的木蝴蝶抗肝肿瘤活性物质发现方法研究”(项目编号:81874342)的一部分。本课题在实验室前期开展的木蝴蝶有效组分提取纯化及其药效筛选研究基础上,采用HPLC等现代分析仪器和方法对木蝴蝶抗肿瘤有效组分总黄酮类进行指纹图谱、含量测定及谱效关系研究,明确其抗肝肿瘤的药效物质基础;采用DEN诱导大鼠肝癌模型及微流控芯片技术,验证木蝴蝶总黄酮及木蝴蝶苷B的体内、外抗肝肿瘤作用;从代谢组学、基因组学、相关基因蛋白等多角度阐释木蝴蝶抗肝肿瘤有效组分总黄酮类抗肝肿瘤的作用机制,为中药木蝴蝶作为抗肝肿瘤药物的临床应用及其进一步开发研究提供实验依据和理论基础。方法1.采用HPLC法,开展木蝴蝶水、醇提取物的指纹图谱研究,并对木蝴蝶苷B进行含量测定;基于木蝴蝶水、醇提取物的指纹图谱,采用灰色关联度分析软件及Pearson相关性分析法,开展木蝴蝶总黄酮类成分与抗肝肿瘤作用的谱效关系研究。2.基于微流控芯片技术,采用Hoechst 33342/PI染色法,以细胞凋亡/坏死率为考察指标,开展木蝴蝶总黄酮及木蝴蝶苷B对人肝癌细胞HepG2增殖作用的影响研究;以细胞相对迁移率为考察指标,开展木蝴蝶总黄酮及木蝴蝶苷B对人肝癌细胞HepG2迁移作用的影响研究。3.采用DEN化学诱导法建立大鼠肝癌模型,以脏器指数、肝脏病理切片、血清中细胞因子的含量、AFP/ALT/AST等酶含量为指标,开展木蝴蝶总黄酮及木蝴蝶苷B体内抗肝肿瘤药效学研究。4.采用HPLC-QTOF-MS技术,并使用Agilent Mass Profiler Professional 12.6软件结合相关数据库,分析木蝴蝶总黄酮和木蝴蝶苷B干预后DEN肝癌大鼠血浆中代谢物的变化及可能参与的代谢通路,从代谢组学方面阐释木蝴蝶总黄酮及木蝴蝶苷B抗肝肿瘤的作用机制。5.应用Illumina二代测序仪及Agilent Microarray Scanner,分别进行木蝴蝶总黄酮及木蝴蝶苷B对DEN肝癌大鼠肝脏组织中转录组基因(mRNA)及非转录组基因(microRNA)表达的影响研究,寻找木蝴蝶总黄酮和木蝴蝶苷B干预后差异表达的mRNA和microRNA,并进行GO分析和代谢通路分析,从基因组学方面阐释木蝴蝶总黄酮及木蝴蝶苷B抗肝肿瘤的作用机制。6.采用PT-PCR和Western Blot法,开展木蝴蝶总黄酮及木蝴蝶苷B对DEN肝癌大鼠肝脏组织相关分子靶点mRNA和蛋白质表达的影响研究。结果1.建立了8个不同产地木蝴蝶水、醇提取物的指纹图谱;木蝴蝶苷B含量测定结果显示,不同产地木蝴蝶水提取物中木蝴蝶苷B的含量分别为13.98、12.94、20.34、16.83、15.78、15.37、18.44、15.78 mg·g~(-1),不同产地木蝴蝶醇提取物中木蝴蝶苷B的含量分别为17.65、26.45、30.99、27.62、23.46、22.62、30.42、24.03 mg·g~(-1);经灰色关联度软件分析可知,木蝴蝶总黄酮中5种主要单体成分对肝癌细胞增殖抑制作用的关联度顺序为:木蝴蝶苷B白杨素-7-O-β-D葡萄糖酸酐木蝴蝶苷A黄芩素白杨素。Pearson相关性分析结果显示,木蝴蝶总黄酮中5种主要单体成分对肝癌细胞增殖抑制作用的关联度顺序为:木蝴蝶苷B黄芩素木蝴蝶苷A白杨素白杨素-7-O-β-D葡萄糖酸酐。2.设计并制作了用于药效筛选研究的微流控芯片,应用该芯片进行的体外药效实验结果表明:木蝴蝶总黄酮和木蝴蝶苷B对人肝癌HepG2细胞均具有明显的增殖抑制作用,抑制率最高分别为78.42%、76.69%。设计并制作了用于细胞迁移研究的微流控芯片,应用该芯片进行的体外迁移实验结果表明:木蝴蝶总黄酮、木蝴蝶苷B均具有显著的抑制人肝癌HepG2细胞迁移的作用,相对迁移率最高分别为8.06%、8.85%。3.建立了DEN诱导大鼠肝癌模型,基于DEN大鼠肝癌模型的体内药效研究结果显示,空白组大鼠肝组织表面红润光滑、质地柔软,模型组大鼠肝组织表面密布瘤状结节,个别瘤体直径超过1 mm,木蝴蝶总黄酮和木蝴蝶苷B各组大鼠肝组织与模型组比较有不同程度的改善;木蝴蝶总黄酮和木蝴蝶苷B能不同程度的降低大鼠的脾指数,提高大鼠的胸腺指数;木蝴蝶总黄酮和木蝴蝶苷B能不同程度的降低大鼠血清中AFP、ALT、AST、TNF-α、IL-12的水平,能够增加大鼠血清中IL-2的水平。4.根据HPLC-QTOF-MS结果,借助相关数据库等分析鉴定木蝴蝶总黄酮及木蝴蝶苷B干预后大鼠血浆中内源性代谢物的变化,结果表明,木蝴蝶总黄酮干预后大鼠血浆中共有285种代谢物发生变化,其中上调的有41种,下调的有244种,如Arachidonic acid、Prostaglandins、N-arachidonoyl L-serine等,推测木蝴蝶总黄酮对DEN肝癌大鼠体内差异代谢物主要与色氨酸代谢、胆汁酸合成、花生四烯酸代谢、亚油酸代谢、丝氨酸代谢等途径有关;木蝴蝶苷B干预后大鼠血浆中共有201种代谢物发生变化,其中上调的有34种,下调的有167种,如Arachidonic acid、Prostaglandins、PA(16:0/18:1(11Z))、Prostaglandin E2(PGE2)等,推测木蝴蝶苷B对DEN肝癌大鼠体内差异代谢物主要与氨基酸代谢、能量代谢、胆汁酸合成、花生四烯酸代谢、Ca离子信号通路、磷脂酶信号通路、MAPK信号通路等途径有关。5.Illumina转录组测序的结果显示,木蝴蝶总黄酮干预组大鼠与模型组大鼠比较,有1491个基因发生变化,其中739个基因上调,752个基因下调;将给药后差异表达的基因进行相关通路注释和富集分析,结果显示木蝴蝶总黄酮干预后的差异表达基因与花生四烯酸代谢、Wnt signaling pathway、Angiogenesis pathway、PI3 kinase pathway、TCA cycle and respiratory electron transport等代谢或信号通路相关。Agilent Microarray Scanner芯片扫描结果显示,木蝴蝶总黄酮干预后有82个microRNA(miRNA)发生变化,其中有23个miRNA上调,59个miRNA下调;木蝴蝶苷B干预后有89个miRNA发生变化,其中有36个miRNA上调,53个miRNA下调。经木蝴蝶总黄酮、木蝴蝶苷B共同调控的miRNA有36个,其中有29个下调,7个上调;差异表达miRNA可能参与MAPK signaling pathway、NF-kappa B signaling pathway、TGF-beta signaling pathway、PI3K-Akt signaling pathway、TNF-αsignaling pathway等信号通路。5.RT-PCR和Western blot结果表明,木蝴蝶总黄酮及木蝴蝶苷B各给药组能不同程度的降低PI3K、p38 mRNA的表达,能增加Akt、PTEN、Caspase 9、Caspase 3 mRNA的表达;木蝴蝶总黄酮及木蝴蝶苷B各给药组能不同程度的降低PI3K、p38、p-p38、TGF-β、p-Akt蛋白质的表达,能增加PTEN、Caspase 9、Caspase 3蛋白质的表达。结论1.不同产地木蝴蝶水、醇提取物中木蝴蝶苷B含量最高的产地均为湖南张家界,且醇提取法得到提取物中的木蝴蝶苷B含量高于水提取法。各单体成分中与抗肝肿瘤药效相关性最大的为木蝴蝶苷B。2.木蝴蝶总黄酮及木蝴蝶苷B具有很好的体外抑制肝癌细胞增殖和迁移的作用。3.木蝴蝶总黄酮及木蝴蝶苷B具有很好的体内抗肝肿瘤作用,在提高肝癌患者生存质量,延长患者生存周期上显示出独特的优势。4.木蝴蝶总黄酮及木蝴蝶苷B对DEN肝癌大鼠体内代谢物有一定调节作用,可能与氨基酸代谢、能量代谢、胆汁酸合成、花生四烯酸代谢、Ca离子信号通路、磷脂酶信号通路、MAPK信号通路等途径有关。5.木蝴蝶总黄酮及木蝴蝶苷B对DEN肝癌大鼠体内转录组基因和非转录组基因均有一定的调节作用,可能与花生四烯酸代谢、Wnt signaling pathway、Angiogenesis pathway、PI3 kinase pathway、TCA cycle and respiratory electron transport、TGF-beta signaling pathway、PI3K-Akt signaling pathway、TNF-αsignaling pathway等代谢或信号通路相关。6.木蝴蝶总黄酮及木蝴蝶苷B促进肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤细胞增殖和转移的作用,可能与调节PI3K/Akt信号通路、p38 MAPK信号通路、TGF-β信号通路中相关分子靶点有关。
【学位授予单位】：辽宁中医药大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R285.5
【图文】：

水提取物,指纹图谱,药材,相似度

密吸取 5 μL，按“2.3”项下色谱条件进行测定，记录 270 nm 波长色谱图，把 8个不同产地的中药木蝴蝶水提物色谱图导入中药指纹图谱相似度评价系统（2012.130723 版）[12-13]，相似度均大于 0.90，RSD 为 0.66%，8 批次木蝴蝶水提取物指纹图谱共有模式见图 1-1-7；

醇提物,指纹图谱,不同产地,药材

2 577.5 605.5 602.3 602.3 592.3 597.1 596.2 1.723 7359.0 7464.5 7442.7 7442.0 7343.3 7327.1 7396.4 0.814 374.7 380.1 379.7 379.0 372.2 373.1 376.6 0.945 7213.5 7312.2 7280.1 7286.4 7170.1 7190.7 7242.2 0.806 5523.4 5613.7 5595.2 5604.9 5497.4 5521.4 5559.3 0.91由表1-2-6、1-2-7可知，各共有峰峰面积相对保留时间的RSD均小于0.09%，相对峰面积的 RSD 均小于 1.72%，表明该方法重复性良好。3.3 不同产地木蝴蝶醇提物指纹图谱的建立取 8 个不同产地的木蝴蝶药材，按“2. 1”项下方法制备供试品溶液，各精密吸取 5 μL，按“2.3”项下色谱条件进行测定，记录 270 nm 波长色谱图，把 8个不同产地的木蝴蝶醇提物色谱图导入中药指纹图谱相似度评价系统（2012.130723 版）[14]，相似度均大于 0.90，RSD 为 0.87%，8 批次木蝴蝶药材醇提物指纹图谱共有模式见图 1-2-7；

矢量图,蝴蝶,芯片,结构示意图

长状态良好的细胞，经 PBS 清洗，用 0.25%的胰酶消化，用 DMEM 培养液制成细胞悬液。调整细胞浓度为 5×104个·mL-1，接种于 96 孔培养板，每孔 100 μL，继续培养 24 h 待细胞贴壁完全。设加药试验孔、空白对照孔（加细胞，但不加药物），每组设 5 个复孔。继续培养 48 h 后，每孔避光加 20 μL（5 mg·mL-1）MTT，继续培养 4 h 后吸净孔内上清液，每孔加入 150 μL DMSO，摇床振摇 10 min，用酶标仪在 492 nm 处扫描，测定吸光值（OD）。细胞的抑制率（%）=（1－OD试验组/ OD对照组）×100%。3 实验结果3.1 药物筛选芯片根据实验需求，本课题组设计一种药物高通量筛选 PDMS-玻璃复合芯片---蝴蝶芯片[24-26]，结合矢量图制图软件 CorelDraw 16.0 对芯片的结构进行设计和优化，借助超高分辨打印机以丝印的方式输出到透明菲林片上制成掩模，结构示意图见图 2-1-1。按照“2.2”项下方法制作芯片，实物图见图 2-1-2。

【参考文献】