金合欢素对视网膜氧化损伤保护作用的机制研究

发布时间：2020-08-19 18:02

【摘要】：目的探讨菊花中六种黄酮类单体对H2O2诱导的人ARPE-19细胞损伤的干预作用及金合欢素减轻H2O2诱导的ARPE-19细胞损伤的机制,在动物实验层面验证金合欢素减轻碘酸钠诱导的大鼠视网膜损伤的作用。方法体外培养人视网膜ARPE-19细胞,MTT实验检测六种黄酮类单体(金合欢素、槲皮素、芹菜素、木犀草素、香叶木素、黄芩素)对ARPE-19细胞的增殖作用及对H2O2诱导的ARPE-19细胞凋亡的影响,FRAP法检测六种黄酮类单体的总抗氧化能力,流式细胞仪检测金合欢素对H2O2诱导的ARPE-19细胞的超氧化物歧化酶(SOD)、活性氧(ROS)、细胞凋亡的影响,QPCR检测金合欢素对H2O2诱导的ARPE-19细胞凋亡通路相关因子mRNA表达,Western Blot检测金合欢素对H2O2诱导的ARPE-19细胞凋亡通路相关因子蛋白的表达。体内实验建立碘酸钠诱导的大鼠急性视网膜损伤模型。将SD大鼠随机分为5组:正常组、盐水组、模型组、金合欢素0.2um/ml组、金合欢素0.4um/ml组。在造模前3天经玻璃体腔穿刺给药右眼分别注入对应浓度的金合欢素和0.9%生理盐水。3天后造模,盐水组、模型组、金合欢素0.2um/ml组、金合欢素0.4um/ml组大鼠经舌下静脉注射40mg/ml碘酸钠(NaIO3)1ml。7天后处死大鼠,收集右眼组织标本。运用RPE铺片、HE染色、TUNEL染色检测视网膜组织的改变。结果MTT实验检测发现六种黄酮类单体对人ARPE-19细胞均有促进增殖作用;金合欢素、槲皮素、木犀草素对H2O2诱导的ARPE-19细胞有抗凋亡作用,槲皮素与金合欢素联合使用可以增强抗凋亡作用。总抗氧化能力:槲皮素、黄芩素、木犀草素组高于对照组,差异有统计学意义。SOD活力:单体组SOD活力高于对照组(P0.05),差异有统计学意义;不同浓度的金合欢素作用后,SOD活力随着剂量的增高而降低。ROS水平:槲皮素、黄芩素、木犀草素、金合欢素、芹菜素组高于对照组(P0.05),差异有统计学意义;不同浓度的金合欢素作用后,ROS的产量随着剂量的增高而降低。流式细胞仪检测金合欢素处理H2O2诱导的ARPE-19细胞后,细胞凋亡减少,在1uM浓度时细胞凋亡最少。QPCR检测发现金合欢素处理后cleaved caspase-3、PEDF、VEGF表达下降,Nrf2表达呈剂量依赖性增加。Western Blot检测发现金合欢素处理后BAX表达下降,Bcl-2、Bcl-2/BAX比值、caspase9、Nrf2呈剂量依赖性增加。RPE铺片发现模型组、盐水组、金合欢素组出现细胞核凋亡、融合,结构紊乱,细胞间隙增大,金合欢素组核溶解较小。HE染色发现模型组、盐水组、金合欢素组结构紊乱,外核层、内核层胞核排列不规则,模型组与金合欢素组相比改变明显,金合欢素组胞核排列较整齐。TUNEL染色后,发现盐水组、模型组凋亡细胞数明显增多,金合欢素组与模型组相比进一步减少。结论1.金合欢素、槲皮素、香叶木素、木犀草素、芹菜素、黄芩素有抗氧化作用,金合欢素、槲皮素、木犀草素有抗凋亡作用,这六种单体可以保护H2O2诱导的ARPE-19细胞的氧化损伤,其中金合欢素的作用最强。2.金合欢素可以减轻H2O2刺激ARPE-19细胞引起的氧化应激反应,修复氧化应激受损的ARPE-19细胞,减少H2O2刺激ARPE-19细胞引起的细胞凋亡,抑制ARPE-19细胞凋亡通路相关因子的表达,维持了细胞稳态。金合欢素通过抗氧化、抗凋亡作用保护H2O2刺激ARPE-19细胞引起的氧化损伤。3.金合欢素作为抗氧化剂可以抑制血管生长因子的分泌。4.金合欢素减轻NaIO3诱导的RPE细胞坏死,减少RPE凋亡,对急性视网膜损伤后的形态学改变有明显的保护作用。
【学位授予单位】：中国中医科学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R285
【图文】：

胞用ＰＢＳ重悬；按照ＦＩＴＣ荧光检测条件检测。逡逑２．逦１２统计学处理逡逑采用ＳＰＳＳ邋２１．０和ＧｒａｐｈＰａｄ邋Ｐｒｉｓｍ邋７．０邋Ｓｏｆｔｗａｒｅ统计软件进行数据分析，逡逑计量资料以均数土标准差（ｘ土ｓｒ表示，组间比较单因素方差分析，两组间比较逡逑采用独立样本ｔ检验，ｐ＜０．邋０５为差异有统计学意义。逡逑３．结果逡逑３．邋１邋Ｈ２０２对ＡＲＰＥ－１９细胞毒性实验结果逡逑ＡＲＰＥ－１９细胞孵育２４小时后，分别加入不同浓度的ＨＡ．（终浓度为６００，邋７００，逡逑８００，９００，邋１０００，邋１１００，邋１２００，１３００，１４００ｕＭ）邋１００ｕｌ，刺激邋ＡＲＰＥ－１９邋细胞，２４ｈ逡逑后加入ＭＴＴ检测细胞存活率。结果显示，不同浓度的ＨＡ与正常组相比，ｐ＜０．邋０５，逡逑结果均有统计学意义；在ｌ000ｕｍ浓度时，细胞凋亡率达到５０％左右，因此，下逡逑面我们选用ｌ000ｕｍ浓度作为造模浓度。逡逑１４０－

六种黄酮类单体、金合欢素联合其他五种单体对人ＡＲＰＥ－１９细胞增殖实验逡逑结果，＊［）〈０？邋０５，＊＊Ｐ＜０．邋０１，＊＊＊Ｐ＜０．邋００１，＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１邋（下同）逡逑３．邋３六种黄酮类单体对ＨＡ刺激的ＡＲＰＥ－１９细胞抗凋亡实验结果逡逑以ｌＯＯＯｕｍ浓度的ＨＡ刺激ＡＲＰＥ－１９细胞２４ｈ后，分别加入不同剂量金合欢逡逑素、槲皮素、香叶木素、木犀草素、芹菜素、黄芩素（终浓度为０．００１，０．０１，逡逑０．１，１，１０，１００，邋２００ｕＭ）刺激ＡＲＰＥ－１９细胞，２４ｈ后加入ＭＴＴ检测细胞凋亡率。逡逑结果显示六种单体刺激ＡＲＩＶ－１９细胞后，细胞存活率呈剂量依赖性／丨？高，在ｌｕＭ逡逑浓度时达到最高峰，之后随剂量升高而下降，说明在ｌｕｍ浓度时单体抗凋亡作用逡逑最强。逡逑再次铺板，以ｌＯＯＯｕｍ浓度的ＨＡ刺激ＡＲＰＥ－１９细胞２４ｈ后，比较六种单体逡逑ｌｕＭ浓度时的细胞存活率，比较金合欢素与其他五种单体联合使用时细胞存活逡逑率，结果显示；与模型组相比，金合欢素、槲皮素、木犀草素抗凋亡作用较强（Ｐ逡逑

邋ＨＡ造模后，六种黄酮类单体不同剂量组对人ＡＲＰＥ－１９细胞抗凋亡实验结逡逑果，Ａ：香叶木素Ｂ：芹菜素Ｃ：木犀草素Ｄ：金合欢素Ｅ：黄芩素Ｆ：槲皮素，＊Ｐ＜０．邋０５，逡逑＊＊Ｐ＜０．０１，邋＊＊＊Ｐ＜０．００１，＊＊＊＊Ｐ〈０．０００１邋（下同）逡逑３４逡逑

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本文编号：2797405