天然九里香丙素靶向抑制TRPV2通道的药理学确证与作用机制研究

发布时间：2020-08-20 14:09

【摘要】：瞬时受体电位香草酸2型受体通道(TRPV2)是一种在外周和中枢神经系统广泛分布的非选择性阳离子通道。TRPV2被高于52℃的伤害性高温、渗透压、机械力和化学刺激等激活。TRPV2在包括褐色脂肪在内的很多组织中高表达,与糖尿病、胰腺炎等疾病有关。然而,由于缺乏特异性的调节剂,对TRPV2通道的生理和药理学功能研究甚少。研究表明,哺乳动物体内脂肪主要分为褐色脂肪(BAT)和白色脂肪(WAT),其中成熟褐色脂肪组织中含有许多线粒体,线粒体中的解偶联蛋白1(UCP1)可以使电子传递解偶联产热,从而产生非颤抖性产热。近期的研究发现,TRPV2通道在褐色脂肪的分化与产热作用中起重要作用。然而,由于缺乏特异性的TRPV2调节剂,TRPV2在褐色脂肪中的作用所知甚少。因此,寻找特异性调节TRPV2的小分子工具用于TRPV2通道的药理学功能研究具有重要意义。研究目的:筛选与鉴别TRPV2特异性抑制剂,评价其对外源性及内源性表达的TRPV2的作用,并确定抑制剂与TRPV2的结合位点,为探讨TRPV2通道的功能及相关研究提供药理学工具。研究方法:采用钙荧光成像Flexstation 3手段,在过表达TRPV2的HEK293细胞中对从九里香植物中分离提取的单体天然产物进行了初步筛选;利用全细胞膜片钳电生理方法记录表达的TRPV2电流,对B304-1和B304-2进行剂量依赖性和选择性的评价;利用PCR、RT-PCR、Western blot、电生理等技术测定TRPV2在褐色脂肪细胞中的表达量,以及B304-1和B304-2对褐色脂肪细胞中内源性TRPV2的作用;利用分子对接和点突变确定B304-1和B304-2与TRPV2通道的结合位点。研究结果:用钙成像实验,Flexstation 3实验确定B304-1和B304-2抑制TRPV2通道,电生理实验说明B304-1和B304-2均可以特异性和剂量依赖性的抑制TRPV2通道,B304-1的IC_(50)为34.2±7.8μM,B304-2的IC_(50)为3.7±0.7μM;TRPV2在褐色脂肪细胞中高表达,并且分化后的褐色脂肪中TRPV2表达量要明显的高于分化前褐色脂肪细胞;B304-1和B304-2可以抑制褐色脂肪细胞中的内源性TRPV2通道并逆转TRPV2激动剂引起的褐色脂肪细胞分化抑制;最后利用分子对接和点突变发现B304-1和B304-2通过与TRPV2通道高门区域结合从而抑制TRPV2通道,与B304-2形成范德华力以及与B304-1形成氢键的600位异亮氨酸(I600)为关键氨基酸。本研究中,我们发现了一对从九里香根部分离提取的天然香豆素对应异构体(-)-murraxocin(B304-1)和(+)-murraxocin(B304-2),两者均可以特异性抑制过表达TRPV2的HEK293细胞中外源性TRPV2以及褐色脂肪细胞中内源性TRPV2电流。对应异构体B304-1和B304-2的发现为进一步阐明TRPV2通道功能提供了工具和化学线索,并且药理学方法调节褐色脂肪细胞中的TRPV2通道可能为治疗能量失衡或代谢疾病提供一种新的治疗策略。研究结论:1.在过表达TRPV2的HEK293细胞中,异构体B304-1和B304-2是TRPV2抑制剂,并且具有较好的剂量依赖性和选择性。2.TRPV2在褐色脂肪细胞中表达,并且在分化后的褐色脂肪细胞中表达更高,说明TRPV2在BAT分化与产热中发挥重要作用。3.B304-1和B304-2可以抑制分化后小鼠褐色脂肪细胞中内源性的TRPV2,B304-1和B304-2可逆转由TRPV2激动剂诱导的褐色脂肪细胞分化抑制,提示B304-1和B304-2可能成为BAT分化与产热功能研究的药理学工具。4.B304-1和B304-2与TRPV2的结合区域为选择性滤器部位,指出了可能的结合口袋,为合成效果更好、选择性更高的TRPV2抑制剂提供了先导化合物。
【学位授予单位】：青岛大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R285.5

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本文编号：2798070