茵栀黄方“退黄”分子机制及药效物质筛选初探

发布时间：2020-08-21 23:06

【摘要】：目的1.建立稳定的高胆红素HepaRG细胞模型;2.通过高胆红素HepaRG细胞模验证茵栀黄“退黄”药效并探究其机制;3.从茵栀黄已报道的化学成分中初步筛选茵栀黄“退黄”的潜在药效物质。方法1.通过胆红素及丙磺舒共同干预HepaRG细胞建立高胆红素细胞模型,以细胞内总胆红素(TBIL)和间接胆红素(IBIL)含量评价细胞模型;2.采用茵栀黄提取物干预高胆红素细胞,以细胞内总胆红素和间接胆红素及细胞外直接胆红素(DBIL)含量为指标评价茵栀黄“退黄”作用;采用RT-q PCR和Western-blot技术考察茵栀黄干预后细胞膜转运体、代谢酶及核受体表达变化,探究茵栀黄“退黄”的分子机制。3.采用茵栀黄干预盐酸苯肼诱导的高胆红素大鼠,制备茵栀黄含药血清,并用含药血清干预高胆红素HepaRG细胞;采用HPLC-MS/MS对茵栀黄提取物、含药血清及细胞摄取物进行分析,筛选出茵栀黄“退黄”的潜在药效物质。结果1.高胆红素细胞模型的建立:高胆红素模型以40μg/mL胆红素和50μg/mL丙磺舒共同干预HepaRG细胞12 h后,细胞内总胆红素及间接胆红素含量最高,且更换含50μg/mL丙磺舒的培养基继续培养可使细胞内高胆红素状态维持在48h内稳定。2.茵栀黄退黄作用及其分子机制研究:720μg/mL茵栀黄提取物(茵陈:18%,栀子:10%,黄芩:60%,金银花:12%)干预高胆红素HepaRG细胞24 h后,茵栀黄组细胞内总胆红素和间接胆红素含量与模型组相比显著下降(P0.01),且细胞外直接胆红素含量显著升高(P0.01),其作用与阳性对照药苯巴比妥相似(P0.05);而RT-q PCR和western-blot结果显示,与模型组相比,茵栀黄组细胞膜转运体多药耐药转运蛋白2(MRP2)、代谢酶UDP-葡萄糖醛酸转移酶1A1(UGT1A1)及核受体组成型雄烷受体(CAR)的m RNA和蛋白表达均显著升高(P0.05)。3.茵栀黄退黄药效物质的初步筛选:茵栀黄干预高胆红素大鼠7 d后,其血清总胆红素、直接胆红素及间接胆红素含量与模型对照组相比均显著降低(P0.05),且大鼠含药血清中测得茵栀黄已报道31种化合物中的10种;而含药血清干预高胆红素细胞后,细胞内测得源于茵栀黄的化合物7种,分别是汉黄芩素、D-焦谷氨酸、异嗪皮啶(6,8-Dimethoxy-7-hydroxycoumarin)、京尼平龙胆双糖苷、Safflor yellow A及2种结构未确定化合物。结论1.本研究通过胆红素及丙磺舒干预HepaRG细胞,建立了稳定的高胆红素细胞模型;2.茵栀黄提取物可降低高胆红素HepaRG细胞内TBIL及IBIL含量,具有显著的退黄作用,其药效与阳性对照药苯巴比妥无差异;而其退黄作用可能与茵栀黄上调核受体CAR的表达而使胆红素代谢酶UGT1A1及外排转运体MRP2的m RNA及蛋白表达增加有关。3.本研究通过细胞摄取含药血清获得的7种化合物,这7种化合物可能为茵栀黄退黄的潜在药效物质。
【学位授予单位】：兰州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R285.5
【图文】：

示意图,胆红素,示意图,黄疸

大学硕士学位论文茵栀黄方“退黄”分子机制及药效物质筛选初探、外界因素如毒素、化学物质等，都会引起黄疸。近年来，分子生物学技术的发展促进了人们对黄疸分子机制的研究，从分子上探究胆红素在体内的代谢、调节等过程，进一步明确了黄疸发病的分子机红素的代谢胆红素是临床诊断黄疸的重要指标，其代谢的场所主要在肝脏[1]，主要包括胞对血液中非结合胆红素（又称间接胆红素，unconjugated bilirubin，UCB）取、非结合胆红素在肝细胞中的运输、非结合胆红素向结合胆红素（又称直红素，conjugated bilirubin，CB）的转化以及结合胆红素通过胆汁的外排互关联的生理过程[10, 11]（见图 1-1）。在这些过程中，有多种酶、转运体及调子参与，而参与胆红素生物转化的这些因子出现表达或功能障碍，可能会导红素代谢的异常，引起黄疸等相关疾病（见表 1-1）。

胆红素,存活率,细胞

学位论文茵栀黄方“退黄”分子机制及药效果细胞毒性考察TT 比色法考察胆红素对 HepaRG 细胞的毒性，初步选定的胆红素干预浓度。为了排除胆红素溶剂 DMSO 对结果 DMSO 的培养基（DMSO : 培养基 = 1 : 20）干预细胞，性，不会影响胆红素的细胞毒性实验。、25、50、100、200、400 μg/mL 胆红素干预 HepaRG 细结果显示，胆红素在干预 24 h 时，25、50 及 100 μg/mL ，而 200 及 400 μg/mL 则有抑制作用。但干预 48 h 后，除 2度的细胞死亡率明显升高，在 100 μg/mL 时细胞死亡率约胞死亡率约为 40%（图 2-1）。因此，本文欲在 0-100 μg/mepaRG 细胞 24 h 筛选高胆红素细胞造模剂量。

胆红素,细胞内,浓度

胆红素干预HepaRG细胞24 h筛选高胆红素细胞造模剂量，通过测定细胞内TBIL和 IBIL 浓度对模型进行评价。结果如图2-2所示，细胞内的TBIL浓度随胆红素的干预浓度的增加而增加，而当胆红素干预浓度达到 40 μg/mL 时，细胞内 TBIL 浓度不再随胆红素干预浓度发生变化， IBIL 变化与 TBIL 相似，说明胆红素干预浓度为 40 μg/mL 时，细

【参考文献】