SLT对缺血缺氧损伤星形胶质细胞功能的影响及保护机制的研究

发布时间：2020-08-24 15:43

【摘要】：脑卒中是一种常见的疾病,绝大多数脑卒中病例是由短暂性或永久性脑血管闭塞引起的缺血性脑血管病(缺血性中风)最终导致脑梗死。缺血性中风是一种高度复杂和异质性的疾病,缺血后兴奋性毒性氨基酸的释放,炎性因子、趋化因子的释放等,都会对神经元产生二次损伤。星形胶质细胞做为脑内大量存在的细胞,是中枢神经系统重要的管家细胞,其在神经兴奋时清除多余的兴奋性递质、控制离子和水分子动态平衡、释放神经营养因子、转移代谢产物和废弃物、参与血脑屏障(blood-brain barrier,BBB)形成、调控局部脑血流等方面有重要作用。因此,探讨星形胶质细胞在缺血性脑血管病中的作用,探索有效中药对其的作用机制,对防治脑血管疾病具有一定的意义。目的:整体与细胞水平,探讨缺血缺氧状态下星形胶质细胞过度增殖、神经递质的传递、炎性反应及LCN2蛋白诱导的相关信号通路的相关性;在此基础上,探讨中药复方SLT及其部分有效成分对星形胶质细胞相关功能的干预作用与相关机制的研究。方法:第一部分——SLT治疗急性期多发性脑梗死大鼠的作用机制研究——采用大鼠微球法至多发性脑梗死实验模型,通过神经行为评分、透射电镜观察星形胶质细胞超微结构、HE染色观察病理学形态评价SLT对皮层区损伤的保护作用;根据组织内及血清内炎性因子的表达,以及qPCR、免疫荧光、免疫印迹观察星形胶质细胞的活化、特异蛋白LCN2及其诱导的JAK2\STAT3信号通路的变化,以考察脑缺血损伤后星形胶质细胞的活化与炎性反应的关系及SLT对缺血损伤皮层区星形胶质细胞功能的影响。第二部分——SLT治疗恢复期多发性脑梗死大鼠的作用机制研究——采用大鼠微球法至多发性脑梗死实验模型,依据前期结果,首先通过microRNA基因组学评价恢复期脑梗死大鼠缺血侧大脑组织内microRNA的变化,根据前期急性期结果寻找相关的靶基因、相关通路以及SLT可能的作用靶点;其次通过Morris水迷宫实验评价SLT对恢复期大鼠空间记忆功能障碍的影响;随后,根据组织内及血清内炎性因子的表达,以及qPCR、免疫荧光、免疫印迹观察星形胶质细胞的活化、特异蛋白LCN2及其诱导的JAK2\STAT3信号通路的变化,以考察恢复期脑缺血损伤后星形胶质细胞的活化与炎性反应的关系及SLT对恢复期缺血损伤皮层区星形胶质细胞功能的影响。第三部分——SLT及主要有效成分抗HA细胞缺氧复氧损伤机制研究——选择SLT及主要活性成分银杏叶总提物进行细胞水平的研究。首先建立人星形胶质细胞——Human Astrocyte细胞培养体系,通过CCK8法考察二者对正常培养HA细胞活力的影响;随后,依据前期基础及参考文献建立HA细胞糖氧诱导(oxygen-glucose deprivation,OGD)损伤模型,并采用慢病毒转染的方法过表达目的基因LCN2,检测细胞分泌炎性因子含量变化,免疫荧光、蛋白免疫印迹观察星形胶质细胞的活化、特异蛋白LCN2及其诱导的JAK2\STAT3信号通路的变化,考察星形胶质细胞损伤后SLT有效成分对其的影响。结果:在第一部分实验中,我们观察到如下结果:与模型组相比,SLT可显著降脑缺血大鼠神经行为评分的分值,银杏叶提取物亦能降低脑缺血大鼠神经行为评分的分值,但较SLT组分值略高;SLT可有效减轻星形胶质细胞的活化及增殖,SLT组缺血侧病变减轻,皮层神经元少量变性,核固缩和核溶解程度减轻,神经元的凋亡与坏死受到抑制,较为明显改善脑脑缺血损伤大鼠皮层缺血周边半暗带区神经元及突触超微结构损伤;SLT可抑制缺血侧皮层区及血清内炎性因子及趋化因子的表达,根据免疫荧光与免疫印迹的结果看出,SLT可能通过抑制LCN2诱导的JAK2/STAT3信号通路的表达来抑制炎性反应。在第二部分试验中,首先我们发现,对于脑缺血恢复期大鼠,SLT可减少部分缺血侧组织的microRNA差异,并可预测到与LCN2-JAK2/STAT3通路有关;其次,SLT及银杏叶提取物可显著降低脑缺血引起的大鼠空间记忆认知功能障碍,与急性期结果相似,SLT可有效减轻星形胶质细胞的活化及增殖,SLT组缺血侧病变减轻,皮层神经元少量变性,核固缩和核溶解程度减轻,神经元的凋亡与坏死受到抑制,较为明显改善脑脑缺血损伤大鼠皮层缺血周边半暗带区神经元及突触超微结构损伤;SLT可抑制缺血侧皮层区及血清内炎性因子及趋化因子的表达,根据免疫荧光与免疫印迹的结果看出,SLT可能通过抑制LCN2诱导的JAK2/STAT3信号通路的表达来抑制炎性反应。第三部分实验中,细胞水平结果与整体水平结果互相印证,SLT与EGB阻断了 OGD诱导的星形胶质细胞内JAK2/STAT3的激活和炎性因子的生成,而LCN2的过度表达显著增强了这些效应;SLT与EGB下调了 LCN2过表达增强的这些效应。结论:(1)缺血缺氧损伤后,星形胶质细胞过度活化增殖,从而诱导一系列的炎性反应,并激活LCN2诱导的JAK2/STAT3信号通路;(2)SLT及其有效成分可能以LCN2为靶点,抑制星形胶质细胞的活化,从而抑制进一步的炎性反应,以达到治疗缺血性脑血管病的目的。
【学位授予单位】：中国中医科学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R285.5
【图文】：

后脑,再灌注,神经炎

鼠的脑缺血再灌注损伤，新生小鼠的缺氧缺血性损伤以及糖氧诱导条件下的神经逡逑元和神经胶质共培养获得的结果表明，ＬＣＮ２通过直接的神经毒性作用参与缺血逡逑性脑损伤，并且加剧了神经炎性反应（图１）。逡逑Ｗａｎｇ等人？通过ｔＭＣＡＯ和永久性大脑中动脉阻塞（ｐｅｒｍａｎｅｎｔ邋ｍｉｄｄｌｅ逡逑ｃｅｒｅｂｒａｌ邋ａｒｔｅｒｙ邋ｏｃｃｌｕｓｉｏｎ，邋ｐＭＣＡＯ）模型证实，ＬＣＮ２对缺血脑中的神经毒性和逡逑神经炎症促进作用。再灌注后，梗死区的星形胶质细胞和嗜中性粒细胞分别检测逡逑２０逡逑

炎性反应,缺血性脑血管病,保护机制,星形胶质细胞

逦ＳＬＴ对缺血性脑血管病星形胶质细胞功能损伤的影响及保护机制的研究逦逡逑活ＩＫＫ／ＮＦ－ｋＢ通路，诱导ＮＯ生成，促进ＧＦＡＰ活化和ＣＸＣＬ１０的生成［１８，１９］。逡逑ＪＡＫ２／ＳＴＡＴ３通路和ＩＫＫ／ＮＦ４Ｂ通路为ＬＣＮ２促进ＣＮＳ发生炎性反应的两个主要通逡逑路。此外，ＬＣＮ２还可通过上调ＩＬ－６和下调ＰＩＡＳ３，使ＳＴＡＴ３活化，诱导ＧＦＡＰ活逡逑化和ＣＸＣＬ１０的生成［２Ｇ，２１］。逡逑

多发性脑梗死,大鼠脑缺血,银杏叶提取物,梗死灶

３结果逡逑３．邋１邋ＳＬＴ及ＥＧＢ对大鼠脑缺血术后２邋ｈ及２４邋ｈ神经行为学评分的影响逡逑与模型组相比较，ＳＬＴ可显著降低脑缺血大鼠神经行为评分的分值，见图１。逡逑｜４１逦＊＊＊逦Ｉ４］逦＊＊＊逡逑ｆ邋３－逦Ｔ逦ｍ邋Ｉ３－逦丁＃＃逡逑２逦丁＃＃邋0逦—邋＃＃逡逑８逦１邋－Ｔ－邋ｓ逦丁邋＿逡逑２－逦，邋丁逦Ｓ邋２－逦Ｔ逡逑Ｓ逦Ｉ＇邋－邋＇邋Ｓ逦；邋；邋１逡逑°邋１－逦■逦＿象１－逡逑■邋２逡逑ｃ邋0Ｊ逦．逦．逦—ｒ－逦１逦邋Ｉ邋０－Ｉ逦．逦．逦邋．逦逡逑？邋＾逦＾逦＾逦／逦凌命逡逑图１邋ＳＬＴ对多发性脑梗死大鼠神经行为学评分的影响（ｘ邋土邋ｓ，邋ｎ邋＝邋１０）逡逑l:l:本ｐ邋＜邋０．００１邋ｖｓ．邋ｓｈａｍ邋ｇｒｏｕｐ；邋＃＃ｐ邋＜邋０．邋０１邋ｖｓ．邋ｔｈｅ邋ｍｏｄｅｌ邋ｇｒｏｕｐ逡逑３．邋２邋ＳＬＴ及银杏叶提取物对脑缺血大鼠梗死面积的影响逡逑ＴＴＣ染色结果显示，脑缺血后有显著的脑梗死灶，与模型组相比，ＳＬＴ与ＥＧＢ逡逑均能减少梗死面积，且ＳＬＴ效果较为显著，结果见图２。逡逑Ｓｈａｍ邋Ｍｏｄｅｌ邋ＥＧＢ逦ＳＬＴ逦Ｓｈａｍ邋Ｍｏｄｅｌ逦ＥＧＢ逦ＳＬＴ逡逑：邋ｊＥＵＩ逡逑ｎｒｉＬ邋ｉｒｉ邋ｎｎｎｎ逡逑ｒｉｎｒｉＬｊ邋ｊｎｉｒｉｒｉｎ逡逑ｎｍｎ邋□□□□逡逑□□□□邋ｔｌ邋口逡逑图２邋ＳＬＴ对多发性脑梗死大鼠脑梗死灶的影响逡逑４８逡逑

【参考文献】