循环微粒与eNOS解耦联在AS早期作用机制及豁痰解毒通络饮的干预研究

发布时间：2020-08-27 09:37

【摘要】：背景动脉粥样硬化是临床多种疾病的基础病变,尽管临床进行了降脂药物的干预,但并没有阻断动脉粥样硬化的发展和结局,以动脉粥样硬化为基础的心脑血管疾病的发病率不断增加,因此探讨动脉粥样硬化新的病理机制并进行有效的干预具有重要的实用价值和科学意义。循环微粒以往被作为细胞垃圾而忽视,近年来发现其可促进动脉粥样硬化的发展,并有潜力成为预测心血管疾病发生发展的新型标志物。内皮功能障碍是动脉粥样硬化的始动环节。而内皮型一氧化氮合酶(eNOS)解耦联导致保护性一氧化氮(NO)合成障碍及氧化应激加剧,是内皮功能障碍的导火索,进一步促进动脉粥样硬化的发展。而四氢生物蝶呤(BH4)的不足或氧化增加是eNOS解耦联发生的最关键因素。近年来研究表明,循环微粒可以通过相关信号通路降低eNOS活性,促进内皮功能障碍的发生。但循环微粒是否可以通过BH4依赖的eNOS解耦联途径促进AS发生则未见报道。中药豁痰解毒通络饮是临床治疗动脉粥样硬化的有效方剂,并可以改善内皮功能,该方是否可以通过调节循环微粒改善动脉粥样硬化的机制有待进一步研究。目的1筛选早期颈动脉粥样硬化人群(CAS)中的循环微粒,并评价循环微粒的诊断价值,为其作为新型生物学标志物评价AS疾病进程提供依据。2评价早期CAS人群内皮功能,分析eNOS、BH4与血脂、心血管风险相关血细胞计数指标的相关性。3研究循环微粒对eNOS解耦联相关途径的作用,探讨循环微粒在早期AS形成过程中的作用机制。4建立兔早期AS模型,探讨中药复方豁痰解毒通络饮改善早期AS的疗效及其对循环微粒/BH4/eNOS解耦联/ROS途径的干预作用。方法1在北京中医药大学东直门医院体检中心查体人群中,根据纳入排除标准筛选出23名早期CAS患者和22名健康受试者,知情同意后自愿参加本试验。采集患者临床资料,晨起空腹采集外周血3ml,梯度离心提取循环微粒,使用BD FACS Canto Ⅱ型流式细胞仪检测白细胞衍生微粒(LMP)CD45、CD11a及CD11a+/CD45+;血小板微粒(PMP)CD31+/CD42b+和内皮微粒(EMP)CD31+CD42b+及不同直径微粒的绝对计数、百分比及四种标记平均荧光强度的表达情况。颈动脉超声测量内中膜厚度(CIMT)及最大斑块面积。对颈动脉超声指标与五种微粒进行相关性分析和诊断试验评价,评价微粒作为评估AS进展指标的诊断灵敏度与特异性。2实验对象同实验一。使用硝酸还原酶法检测外周血中一氧化氮(NO)表达水平,酶法检测早期颈动脉粥样硬化患者外周血中血脂四项水平,全自动血细胞分析仪检测患者血细胞计数水平,使用ELISA法检测两组内皮素-1(ET-1)、eNOS、BH4表达量。3根据前期获得微粒数量进行适用动物体重评估后,选用雄性昆明小鼠(20～22g),共36只,随机分为CAS微粒组,健康人微粒组,对照组(生理盐水),BH4组(灌胃3天,10mg/kg),每组9只。通过小鼠尾静脉分别注射CAS微粒和健康人微粒,并以注射生理盐水作为对照,BH4组提前灌胃BH4 3天(10mg/kg)再注射CAS微粒。注射24h后摘眼球取血并取材心脏和胸主、腹主动脉。HE染色观察血管病理结构,Western-blot法检测小鼠循环组织中eNOS二聚体/eNOS单体、三磷酸鸟苷环水解酶-1(GTPCH-1)、内皮素受体A、内皮素受体B的蛋白含量。免疫组化法检测ETRA、ETRB、血管平滑肌肌动蛋白-α及增殖细胞核抗原的表达。硝酸还原酶法检测小鼠循环组织中一氧化氮(NO)的表达水平。ELISA检测小鼠心血管组织匀浆上清中的超氧化物(ROS)、二氢生物蝶岭(BH2)、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)水平。4选用雄性日本大耳白兔(1.6～1.8 kg),进行早期AS模型的制作。方法采用高脂饲料喂养加内膜氮气干燥术加颈动脉球囊拉伤。使用高分辨率小动物超声及病理对模型进行评价。模型动物根据球囊压力水平及体重随机分组,随机分为模型组、豁痰解毒通络饮组、阿托伐他汀组,另有假手术组(普通饲料)做对照,共4组。取材后进行腹主动脉大体油红O染色评估脂质沉积,过氧化物酶法检测血脂四项,ELISA法检测血清OX-LDL及BH4,HE染色检测损伤血管病理变化及组织学内径等形态学指标,流式细胞技术检测循环微粒的表达,生化法检测血清ROS表达,Western-blot法检测循环组织中eNOS二聚体/eNOS单体比值。结果1早期CAS组患者的外周循环血浆中的白细胞微粒CD45+ LMP/μl,CD1 1a+LMP/μl及CD11a+/CD45+LMP/μl、血小板微粒CD31+/CD42b+ PMP/μl1计数显著高于健康人组(p0.01)。但是,两组的外周循环血浆中的内皮微粒CD31+CD42b-EMP/μl无显著统计学差异(p0.05)。早期CAS组患者的外周循环血浆中的白细胞微粒CD11a+LMP%,CD45+LMP%及CD11a+/CD45+LMP%百分比显著高于健康人组(p0.05)。早期CAS组患者外周循环血浆中的血小板微粒CD31+/CD42b+ PMP%百分比亦显著高于健康人组(p0.05)。但是,两组的外周循环血浆中的内皮微粒CD31+CD42b-EMP%百分比无显著统计学差异(p0.05)。两组不同直径微粒总计数、百分比差异无统计学意义(p0.05)。两组四种荧光标记的平均荧光强度差异无统计学意义(p0.05)。在早期CAS患者组,年龄、性别、合并症与 CD45+LMP/μl,CD11a+LMP/μl,CD11a+/CD45+LMP/μl 及CD31+/CD42b+ PMP/μl的数量之间无线性相关性(p0.05)。在早期CAS患者中的外周循环血浆中 CD45+ LMPμl,CD11a+ LMP/μl,CD45+/CD11a+LMP/μl及CD31+/CD42b+PMP/μl的数量与最大斑块面积呈显著正相关。不仅如此,早期CAS组外周循环血浆中的CD11a+LMP/μl,CD11a+/CD45+MP/μl数量还与CIMT呈显著正相关。CD45+LMP/μ1,CD11a+LMP/μl,CD11a+/CD45+LMP/μl及 CD31+/CD42b+PMP/μl 的 ROC 曲线下面积分别为 0.689(95%CI,0.531-0.847,p=0.030),0.747(95%CI,0.604-0.890,p=0.005),0.741(95%CI,0.596-0.886,p=0.006)及 0.701(95%CI,0.545-0.856,p=0.021),诊断界点分别为4.07,2.73,2.15及7.64,灵敏度分别为61%,57%,57%,61%,特异度分别为 77%,86%,86%及 82%。2早期CAS组人群的血浆eNOS、BH4表达水平显著低于健康人,差异有统计学意义(p0.05)。CAS组人群的血小板计数、白细胞计数与健康人组相比显著升高(p=0.04,p=0.00),CAS组人群血小板/淋巴细胞(PLR)与健康人相比有上调趋势,但差异无统计学意义(p=0.09)。血脂方面,CAS组人群总胆固醇,甘油三酯,低密度脂蛋白表达量较健康人组显著升高,差异有统计学意义(p值均小于0.05)。其余血细胞参数及高密度脂蛋白水平两组比较差异无统计学意义(p0.05)。在早期CAS患者中,血浆eNOS与总胆固醇水平、低密度脂蛋白水平、白细胞计数、血小板计数、PLR、中性粒细胞计数呈显著负相关(p0.05),BH4与红细胞计数呈显著正相关(p0.05)。3生理盐水对照组小鼠循环组织(心脏和血管)中的eNOS单体表达极少,而其余三组小鼠循环组织中的eNOS单体的表达均有不同程度增加,其中,注射早期CAS患者循环微粒及正常人微粒能够显著引起小鼠组织中的eNOS解耦联,表现为eNOS二聚体/eNOS单体显著下降(与注射生理盐水对照组比较,p0.01,p0.05),注射早期CAS患者循环微粒组与注射正常人循环微粒组比较,eNOS二聚体/eNOS单体显著下降(p0.05),说明早期CAS患者循环微粒能够引起程度更重的eNOS解耦联。灌胃四氢生物蝶呤(BH4)可以显著逆转早期CAS患者循环微粒引起的心血管系统中eNOS的解耦联(与早期CAS患者组比较p0.05)。四组小鼠循环系统中的GTPCH-1表达无统计学差异(p0.05)。与注射生理盐水组小鼠相比较,注射早期CAS患者循环微粒组、注射健康人循环微粒组的小鼠组织中的过氧化物(ROS)显著上调(p=0.006,p=0.000)。注射CAS患者微粒、健康人微粒组及BH4组小鼠组织内iNOS与生理盐水组比较显著上调(p=0.045,p=0.000,p=0.000)。且注射正常人微粒组的小鼠组织表达iNOS较注射早期CAS患者微粒组的小鼠循环组织中的iNOS显著上调(p=0.019),BH4组较CAS组及健康人微粒组显著上调(p=0.000,p=0.000)。CAS微粒组、正常人微粒组小鼠及BH4干预组的组织中一氧化氮(NO)含量均较注射生理盐水组小鼠显著升高(p=0.001,p=0.000,p=0.001)。注射正常人微粒、BH4组的小鼠循环组织中BH2表达量显著上调(与生理盐水组比较,p=0.005,p=0.001),循环微粒对ETRA、ETRB、α-SMA及PCNA无显著影响,HE染色显示各组血管结构无异常改变。4高分辨率超声评价AS模型发现内中膜厚度及舒张期血流速度较假手术组显著增加(p0.01,p0.05),局部散在斑块形成。HE染色发现,该模型病理结构特点为内膜增厚,中膜大量泡沫细胞沉积,外膜亦有增厚,血管腔轻度狭窄[狭窄率为(25.59±10.11)%],符合早期动脉粥样硬化病理特点,适用于早期AS病变血管重构的干预研究。5对模型组、豁痰解毒通络饮组、阿托伐他汀组的高脂饲料每日进食量进行统计,发现平均每日进食量比较无统计学差异(p0.05)。取材前模型组生存率为80.0%,阿托伐他汀组生存率为46.7%,而豁痰解毒通络饮组生存率为81.8%。假手术组术后生存率为85.7%。模型组主动脉油红O染色阳性面积显著升高(与假手术组比,p=0.002);与模型组比,豁痰解毒通络饮组能显著降低主动脉油红O染色阳性面积(p=0.048),阿托伐他汀组具有降低脂质沉积的趋势,但差异无统计学意义(p=0.172)。与模型组比较,豁痰解毒通络饮组及阿托伐他汀组的肝脏大体外观包括脂质附着明显减轻、质地、颜色更接近正常。模型组兔血清总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)及氧化低密度脂蛋白(OX-LDL)均较假手术组显著升高(p0.01)。豁痰解毒通络饮能够显著降低兔血清总胆固醇及氧化低密度脂蛋白(OX-LDL)水平(p0.05)。模型组与假手术比较,内膜厚度、内膜面积、狭窄率及外膜厚度均显著增加(p=0.008,p=0.009,p=0.008,p=0.022),而豁痰解毒通络饮可以降低模型的内膜厚度、内膜面积、狭窄率及外膜厚度(与模型组相比较,p=0.037,p=0.048,p=0.042,p=0.021)。模型组血浆循环白细胞微粒CD11a+LMP较假手术组显著升高(p0.01)。豁痰解毒通络饮能够显著降低血浆循环白细胞微粒CD11a+LMP水平(与模型组相比较,p0.05)。阿托伐他汀有降低血浆循环白细胞微粒CD11a+LMP水平的趋势,但无统计差异(p=0.147)。模型组与假手术组比较,eNOS二聚体/单体显著下调(p0.01),豁痰解毒通络饮能够显著上调兔AS早期模型颈总动脉中eNOS二聚体/单体的比值(p0.01)。模型组血清中BH4较假手术组显著下调(p=0.045)。豁痰解毒通络饮组及阿托伐他汀组血清中BH4较模型组有上调趋势,但差异无统计学意义(p=0.084,p=0.106)。模型组血清中ROS较假手术组显著升高(p=0.007)。豁痰解毒通络饮组血清中ROS较模型组显著下调(p=0.043)。结论1白细胞微粒计数CD45+LMP/μl,CD11a+MP//μl,CD11a+/CD45+MP/μl及血小板微粒计数CD31+/CD42b+ MP/μl都是有潜力的预测颈动脉粥样硬化发展的新型生物学标志物。2早期CAS患者循环中可能发生了 BH4相关的eNOS解耦联。CAS组患者的白细胞计数、血小板计数、总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白显著高于健康人。eNOS水平与血脂、血细胞计数相关性分析提示血脂增高、炎症反应、血小板增多均与BH4相关的eNOS解耦联密切相关。3循环微粒可以通过BH4/eNOS解耦联/ROS及iNOS/NO/ROS途径导致氧化应激反应,造成内皮功能障碍。早期CAS患者的循环微粒与健康人相比较,导致eNOS解耦联的程度更重,是导致早期AS病理进程中内皮功能障碍的原因之一。4豁痰解毒通络饮能够显著降低兔早期AS模型的总胆固醇、OX-LDL水平、脂质沉积面积、血管内膜、外膜厚度及管腔狭窄率从而显著改善动脉粥样硬化的血管重构。在机制方面,其能够显著下调循环CD11a+白细胞微粒水平,并具有升高BH4的趋势,显著改善eNOS解耦联并下调ROS的表达,说明其可能通过循环微粒/BH4/eNOS解耦联/ROS途径改善早期AS。
【学位授予单位】：北京中医药大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R285
【图文】：

白细胞,微粒,进程,斑块

ＮＯ合成酶活性减少，ＮＯ，氧化应激上调。相反，携带的ＬＭＰｓ可以通过Ｓｈｈ途径生和纠正内皮损伤。逡逑Ｂ．斑块进展，ＬＭＰｓ具有白细胞间粘附分子（ＩＣＡＭ）邋－１，胞活化，粘附，迁移。起源的ＬＭＰｓ具有活性的抗炎能抑制白细胞与内皮细胞互作用。泡沫细胞衍生的Ｍ焦点粘附和肌动蛋白细胞ＶＳＭＣ迁移和粘附的增加。逡逑Ｃ．易损斑块。由Ｔ细胞和ＬＭＰｓ可以促进基质金属蛋族多种成员的合成．ＰｌａｑｕｅＭＭＰ－１，邋ＭＭＰ－８邋和邋ＭＭＰ－１细胞衍生的ＭＰｓ含有ＭＭＰ导致斑块不稳定。来自症状的ＭＰｓ递送更多的ＣＤ４０Ｌ导内皮细胞增殖。相反，ＭＰＳ通过减少血管内皮生ＶＥＧＦ受体２信号通路来显ｙＪｏ逡逑Ｄ．单核细胞衍生的ＭＰｓ通过ＴＦ对内皮细胞膜和内皮细性来上调内皮细胞凋亡和夕卜，血栓调节蛋白（ＴＭ）子途径抑制剂（ＴＦＰＩ）正

定量表达,微珠,标准品,健康人

循环血浆中的血小板微粒ＣＤ３１＋／ＣＤ４２ｂ＋ＰＭＰ／ｕｌ数目亦显著氋于健康人组（ｐ＜０．０５）。逡逑但是，两组的外周循环血浆中的内皮微粒ＣＤ３１＋ＣＤ４２ｂ－ＥＭＰ无显著统计学差异（户＞０．０５）逡逑（见表２；图１）。逡逑４５逡逑

微粒,百分比,健康人,内皮

组患者外周循环血浆中的血小板微粒ＣＤ３１＋／ＣＤ４２ｂ＋ＰＭＰ％百分比亦显著高于健康人组逡逑（ｐ＜０．０５）。但是，两组的外周循环血浆中的内皮微粒ＣＤ３１＋ＣＤ４２ｂ－ＥＭＰ％无显著统计逡逑学差异（；？＞0．0５）（见表３，图２）。逡逑表３两组循环微粒的百分比（Ｍｅｄｉａｎ［２５％－７５％］）逡逑微粒表达量逦健康人逦早期ＣＡＳ逦ｐ邋（ｔ逡逑＿￣ＣＤｌｌａ＋ＬＭＰ／ｕｌ逦０．７０［０．３８－１．３０］逦１．２０［０．６０－２．８０］逦０．０２１＊￣逡逑ＣＤ４５＋邋ＬＭＰ／邋ｕ邋１逦１．３０［０．８５－２．２０］逦２．６０［１．１０－３．１０］逦０．０４３＊逡逑ＣＤ４５＋ＣＤ１邋ｌａ＋ＬＭＰ／邋ｕ邋１逦０．５０［０＿２０－０．９０］逦０．９０［０．４０－２．１０］逦０．０２３＊逡逑ＣＤ３邋ｌ＋ＣＤ４２ｂ＋邋ＰＭＰ／邋ｕ邋１逦２．３０［１．

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