马齿苋多糖的提取分离及其抗溃疡性结肠炎作用机理研究

发布时间：2020-09-07 10:35

　　目的以马齿苋多糖为研究对象,将膜分离技术与传统水提醇沉相结合,优化马齿苋多糖提取、分离、纯化工艺;通过体内药效实验,研究马齿苋多糖治疗溃疡性结肠炎的作用效果及其分子机制,为马齿苋的进一步开发利用提供科学依据。方法1.采用L9(43)正交实验对马齿苋多糖的提取工艺进行优化;将不同孔径的膜联用对马齿苋多糖进行纯化,对马齿苋粗多糖脱蛋白和脱色素工艺进行优化;采用Fenton反应、邻苯三酚自氧化反应研究马齿苋多糖清除羟基自由基、超氧离子自由基活性;2.采用HE染色法,观察马齿苋多糖高、中、低剂量组治疗后,DSS诱导UC小鼠模型结肠黏膜层病理形状的改变;ELISA法检测小鼠血清中TNF-α、IL-6、NO及IL-10的含量;3.免疫组化法检测NF-κB/P65、p-STAT3、COX-2在小鼠结肠组织黏膜层的表达;Western blot法检测TNF-α/NF-κB、IL-6/STAT3信号通路关键蛋白NF-κB/P65、IKBα、STAT3、p-STAT3的表达水平。结果1.马齿苋多糖最佳提取条件为100℃,3 h,4次。三氯乙酸法和过氧化氢法脱蛋白、脱色素多糖的回收率分别为9.66%、17.09%。膜分离研究表明0.8μm陶瓷膜渗透液中,纯化后的马齿苋多糖回收率为61.63%。马齿苋多糖对羟基自由基、超氧离子自由基的清除率分别为58.89%、38.89%。2.DSS诱导UC小鼠模型中,马齿苋多糖高、中、低剂量组治疗后,结肠黏膜上皮细胞排列恢复整齐;与空白组相比,模型组小鼠血清中TNF-α、IL-6、NO含量明显上升(p0.01、p0.05),IL-10含量降低(p0.01)。马齿苋多糖灌胃治疗组,TNF-α、IL-6、NO含量下降,IL-10表达升高。且TNF-α、NO和IL-10在马齿苋多糖高、中剂量组的表达与阳性药相比无显著性差异(p0.05)。IL-6在马齿苋多糖中剂量组的表达与阳性药相比无显著性差异(p0.05)。3.免疫组化结果表明,与空白组相比模型组中NF-κB/P65、p-STAT3、COX-2三种炎症信号通路关键蛋白的表达量显著升高(p0.01)。多糖中剂量灌胃给药后阳性表达降低,与模型组相比NF-κB/P65、p-STAT3、COX-2表达有极显著性差异(p0.01),且NF-κB/P65、p-STAT3的阳性表达率与阳性药组无显著性差异(p0.05);Western blot实验结果表明,在TNF-ɑ/NF-κB信号通路中,与空白组相比模型组抑制蛋白IKBα表达降低,细胞质中NF-κB/P65表达降低(p0.01),而细胞核NF-κB/P65表达升高(p0.01)。多糖中剂量灌胃治疗后,抑制蛋白IKBα表达升高,细胞核中NF-κB/P65表达降低。在IL-6/JAK/STAT3通路中,模型组p-STAT3、STAT3的表达明显上升(p0.01),马齿苋多糖中剂量灌胃给药组,表达降低且p-STAT3的表达与阳性药比无显著性差异(p0.05)。结论本论文将传统工艺与膜分离技术相结合优化马齿苋多糖提取、分离、纯化工艺,探讨马齿苋多糖治疗溃疡性结肠炎作用机制。研究结果表明马齿苋多糖通过调控TNF-α/NF-κB和IL-6/STAT3信号通路,调控相关细胞因子的表达,降低炎症反应,减少黏膜损伤,达到治疗溃疡性结肠炎的作用。但是中药治疗疾病是从多途径、多方位、多靶点发挥作用,马齿苋多糖治疗溃疡性结肠炎作用机理还需进一步研究。
【学位单位】：陕西中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2017
【中图分类】：R284;R285.5
【部分图文】：

流程图,流程,马齿苋科,标准曲线

购自陕西省药材市场，经陕西中医药大学生药教研室主任王高级实验师鉴定为马齿苋科马齿苋属植物马齿苋 Portulaca oleracea L.的全-无水葡萄糖(批号：110833-201205，质量分数 95%～99%)由中国食品药品检究院提供，其它试剂均为分析纯，活性炭。VaCo5 型低温冷冻干燥仪(Zirbus Technology)，TGL-20B 离心机(上海安亭仪器)，LNG-CM-101 实验室膜分离设备(上海朗级膜分离设备工程有限公司实验方法与结果1 标准曲线的绘制用双蒸水配置浓度为 0.2 mg/mL 的葡萄糖标准品液，稀释成 0.025、0.075、0.1、0.15 mg/mL，吸取 0.6 mL 葡萄糖标准品稀释液，加入 4 mL 浓 H2S2 mL 新制 5% C6H5OH 溶液，100℃水浴 30 分钟后在 490 nm 处测定吸光度制标准曲线，得回归方程为 Y=5.9589X+0.0735，r2=0.9957 线性范围025~0.150 mg/mL 结果见图 2-2。2 多糖的提取2.1 工艺流程

标准曲线,单因素实验,多糖,标准曲线

图 2-2 多糖标准曲线及单因素实验结果2.4 正交实验L9(43)正交实验。结果见表 2-4、2-5。表 2-4 马齿苋多糖提取正交实验结果序号 A 温度(℃) B 时间(h) C 次数(次) 提取率(%)1 80 2 2 7.472 80 3 3 9.693 80 4 4 12.414 90 2 3 8.785 90 3 4 12.246 90 4 2 8.327 100 2 4 13.758 100 3 2 13.029 100 4 3 11.88K1 9.86 10.00 9.60

抗氧化活性,超氧离子自由基,多糖,质量浓度

马齿苋多糖的提取分离及其抗溃疡性结肠炎作用机理研究A2/t 为加入样品溶液后邻苯三酚自氧化反应速率参照 2.2.1 工艺流程取马齿苋精制多糖，测定马齿苋多糖对超氧离子自由基的清除活性。结果见表 2-10。表 2-10 马齿苋多糖清除超氧离子自由基活性多糖质量浓度(mg/mL) 2 4 8 12 16清除率(%) 7.78 6.67 15.56 24.44 38.89由表 2-10、图 2-3 可知，马齿苋多糖具有清除超氧离子自由基的作用，在 2~16mg/mL 多糖质量浓度范围内，随着多糖质量浓度的升高清除率增高。

【参考文献】