一项关于PEG化姜黄素衍生物（Curc-mPEG454）的比较研究：抗炎和抗氧化活性
发布时间：2020-09-07 21:20
背景:姜黄素(Curcumin)是从植物姜黄中分离出来具有抗炎、抗氧化等多种药理活性的天然多酚,具有潜在的临床价值。因姜黄素水溶解性差,口服生物利用度低,极大限制其临床应用。我们通过构建聚乙二醇修饰后的姜黄素衍生物(Curc-mPEG454),明显改善姜黄素的水溶性和生物利用度。前期研究证实Curc-mPEG454减轻肝纤维化程度与显著抑制环氧合酶2(COX-2)表达密切相关。因此,本研究采用脂多糖(LPS)诱导的小鼠巨噬细胞RAW264.7作为炎症模型,以姜黄素、阿司匹林、NS-398和维生素C做对照,在体外系统评估Curc-mPEG454抗炎和抗氧化活性,并阐明其可能的分子作用机制。材料与方法:1.细胞模型和分组:用含10%血清的DMEM培养基培养RAW264.7小鼠巨噬细胞,待细胞状态良好时将细胞分为七组:正常对照组,LPS模型组,CurcmPEG454(16μM),姜黄素(16μM),阿司匹林(100μM),NS-398(50μM)和维生素C(300μM)预处理2h,随后,除正常对照组外,其余各组均用1μg/ml脂多糖(LPS)刺激细胞24小时。2.炎症因子的检测:ELISA检测各组细胞上清中炎症因子的含量,包括白介素6(IL-6)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、前列腺素E2(PGE2)、一氧化氮(NO)。荧光定量PCR(Real-Time PCR)检测环氧合酶-2(COX-2)、单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)、白细胞介素1β(IL-1β)和一氧化氮合酶(iNOS)的mRNA的表达水平。Western Blot检测COX-2和iNOS的蛋白表达水平。3.ROS的检测:DCFH-DA标记细胞内的ROS,使用激光共聚焦和流式细胞术检测各组细胞活性氧类的(ROS)水平。4.抗氧化活性的检测:的蛋白和mRNA的表达。酶活性检测试剂盒和PCR检测了细胞中抗氧化酶类,包括血红素加氧酶(HO-1)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)、过氧化氢酶(CAT)酶的活性以及他们的mRNA表达水平。5.核转录因子的检测:Real-Time PCR和Western Blot分别检测(NF-κB),-c-Jun的核蛋白和mRNA的表达水平,同时应用激光共聚焦技术检测NF-κB p65的和转位情况和p-c-Jun核内表达的情况。6.统计所有实验数据,以平均数±标准差表示,采用SPSS19.0软件中的单因素方差分析组间数据是否具有差异性,当P0.05认为组间差异具有统计学意义。结果:1.Curc-mPEG454抑制炎症介质的释放:Curc-mPEG454(IC50 57.8μM)与姜黄素(IC50 32.6μM)相比,其细胞毒性较低,并呈浓度依赖性抑制炎性细胞因子IL-6,TNF-α,IL-1β和MCP-1的释放。在相同浓度下,16μM CurcmPEG454也显示出比姜黄素更强的对炎症细胞因子的抑制作用(P0.05)。2.Curc-mPEG454显著下调COX-2表达,减少PEG2生成:LPS诱导升高细胞COX-2的表达量,而Curc-mPEG454(16μM)最能够抑制COX-2蛋白和mRNA的表达继而抑制前列腺素E2(PGE2)的产生,却不影响COX-2酶的活性。阿司匹林(100μM)和NS-398(50μM)能够明显降低PGE2的水平,主要通过抑制COX-2酶的活性但并不显著改变COX-2的表达水平。3.Curc-mPEG454抑制NF-κB p65核转位和降低p-c-jun水平。在模型组中LPS诱导细胞内NF-κB p65核转位和p-c-jun的表达水平升高,与模型组比较,细胞核内的荧光结果显示Curc-mPEG454(16μM)明显减少LPS诱导的NF-κB p65核转位和p-c-jun磷酸化水平。而阿司匹林(100μM)和NS-398(50μM)轻微减少了NF-κB p65核转位和p-c-jun的表达水平。Curc-mPEG454降低LPS诱导的NF-κB p65核转位和p-c-jun的表达水平是最为明显的。4.Curc-mPEG454抑制LPS诱导的iNOS表达,NO和ROS产生:CurcmPEG454(16μM)能明显降低LPS诱导的iNOS的产生并抑制NO和ROS的生成,而阿司匹林(100μM)和NS-398(50μM)则并不能降低LPS诱导的ROS和NO的产生。而Curc-m PEG454(16μM)和Curcumin(16μM)的抑制效果基本相同。5.Curc-mPEG454通过激活Nrf2及下游抗氧化酶类发挥抗氧化作用:CurcmPEG454(16μM)在6h、12h、24h三个时间点对Nrf2核蛋白和mRNA的表达呈先升高后下降的趋势。在炎症的早期,Curc-mPEG454(16μM),Curcumin(16μM)和维生素C(300μM)能够通过激活Nrf2,升高其下游的抗氧化酶类HO-1,GSH,SOD,CAT的活性,而阿司匹林(100μM)和NS-398(50μM)并不能升高Nrf2的表达和其下游的抗氧化酶的活性。Curc-mPEG454具有和Curcumin、维生素C等同的抗氧化能力。结论:Curc-mPEG454通过抑制NF-κB p65核移位,抑制c-Jun磷酸化和抑制COX-2的表达发挥抗炎作用。其次,Curc-mPEG454通过增加Nrf2的表达,升高其下游的HO-1,GSH,SOD,CAT等抗氧化酶系统发挥抗氧化作用。聚乙二醇化姜黄素不仅改善姜黄素的水溶性,提高其生理活性,而且作用于炎症反应和抗氧化反应的的多个靶点,其抗炎效果优于阿司匹林和NS-398,抗氧化能力等同维生素C。
【学位单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R285.5
【部分图文】：
图 1. 姜黄素和聚乙二醇化姜黄素衍生物Figure 1.The chemical structure of Curcumin and Curc-mPEG454主要实验试剂 供应商姜黄素 Sigma-AldrichLPS Sigma-Aldrich维生素 C Sigma-Aldrich阿司匹林 Sigma-AldrichNS398 Cayman chemical氯仿 重庆医科大学设备与试剂中心甲醇 重庆医科大学设备与试剂中心10 X loading buffer TaKaRaRnase-free 水 TaKaRaDMEM Gibco（美国）胎牛血清 Gibco（美国）双抗(PS) 实验室配制0.25%胰蛋白酶 实验室配制
图 2. Curc-mPEG454 对 RAW264.7 细胞活力的影响。Figure. 2 Effects of Curc-mPEG454 on RAW264.7 cell viability. Cells were pretreated wiincreasing concentrations of Curc-mPEG454 or curcumin for 2h, then incubated in medcontaining LPS (1μg/mL) for 24h at 37℃. Cell viability was determined by using acolorimetric MTT assay. The data shown represent the mean ±SD, from three independeexperiments..2 Curc-mPEG454抑制LPS诱导的促炎细胞因子姜黄素具有较好的抗炎能力可能是通过其抑制炎症前细胞因子如肿瘤坏子（TNF-α），白细胞介素（IL）-1,6，环氧合酶-2（COX-2）和诱导型一氮合酶（iNOS）[17]。在这里，我们研究了Curc-mPEG454对LPS激活AW264.7细胞中几种关键炎症因子IL-1，IL-6，TNF-α和MCP-1的抑制作用姜黄素（16μM），阿司匹林（100μM）[18]和NS-398（50μM）相比[19]。如A，B所示，Curc-mPEG454以浓度依赖性方式抑制IL-6和TNF-α的炎症因子
19图3. Curc-mPEG454对LPS诱导的炎性细胞因子产生的影响。Figure. 3 Effects of Curc-mPEG454 on LPS-induced inflammatory cytokineproduction.RAW264.7 cells were pretreated with indicated concentrations of Curc-mPEG454, curcumin, aspirin and NS-398 for 2h, and then were activated with 1μg/mL LPSfor 24h. Cell culture media was collected and analyzed for IL-6 (A) and TNF-α (B) levelsusing ELISA kit. Gene expression of IL-1β (C) and MCP-1 (D) was calculated usingcomparative cycle threshold (CT) method normalized to the house keeping gene GAPDH.The data shown represent mean ±SD, from three independent experiments.###P < 0.001vscontrol group; *P < 0.05, **P < 0.01, ***P <0.001vs model group.3.3 Curc-mPEG454抑制LPS诱导的COX-2表达和前列腺素E2的合成姜黄素与NSAIDs均能抑制前列腺素（PGs）合成起到对抗炎症的作用[20]。环氧合酶（COX）是负责将花生四烯酸转化为PGs的关键酶。越来越多的证据表
本文编号：2813849
【学位单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R285.5
【部分图文】：
图 1. 姜黄素和聚乙二醇化姜黄素衍生物Figure 1.The chemical structure of Curcumin and Curc-mPEG454主要实验试剂 供应商姜黄素 Sigma-AldrichLPS Sigma-Aldrich维生素 C Sigma-Aldrich阿司匹林 Sigma-AldrichNS398 Cayman chemical氯仿 重庆医科大学设备与试剂中心甲醇 重庆医科大学设备与试剂中心10 X loading buffer TaKaRaRnase-free 水 TaKaRaDMEM Gibco（美国）胎牛血清 Gibco（美国）双抗(PS) 实验室配制0.25%胰蛋白酶 实验室配制
图 2. Curc-mPEG454 对 RAW264.7 细胞活力的影响。Figure. 2 Effects of Curc-mPEG454 on RAW264.7 cell viability. Cells were pretreated wiincreasing concentrations of Curc-mPEG454 or curcumin for 2h, then incubated in medcontaining LPS (1μg/mL) for 24h at 37℃. Cell viability was determined by using acolorimetric MTT assay. The data shown represent the mean ±SD, from three independeexperiments..2 Curc-mPEG454抑制LPS诱导的促炎细胞因子姜黄素具有较好的抗炎能力可能是通过其抑制炎症前细胞因子如肿瘤坏子（TNF-α），白细胞介素（IL）-1,6，环氧合酶-2（COX-2）和诱导型一氮合酶（iNOS）[17]。在这里，我们研究了Curc-mPEG454对LPS激活AW264.7细胞中几种关键炎症因子IL-1，IL-6，TNF-α和MCP-1的抑制作用姜黄素（16μM），阿司匹林（100μM）[18]和NS-398（50μM）相比[19]。如A，B所示，Curc-mPEG454以浓度依赖性方式抑制IL-6和TNF-α的炎症因子
19图3. Curc-mPEG454对LPS诱导的炎性细胞因子产生的影响。Figure. 3 Effects of Curc-mPEG454 on LPS-induced inflammatory cytokineproduction.RAW264.7 cells were pretreated with indicated concentrations of Curc-mPEG454, curcumin, aspirin and NS-398 for 2h, and then were activated with 1μg/mL LPSfor 24h. Cell culture media was collected and analyzed for IL-6 (A) and TNF-α (B) levelsusing ELISA kit. Gene expression of IL-1β (C) and MCP-1 (D) was calculated usingcomparative cycle threshold (CT) method normalized to the house keeping gene GAPDH.The data shown represent mean ±SD, from three independent experiments.###P < 0.001vscontrol group; *P < 0.05, **P < 0.01, ***P <0.001vs model group.3.3 Curc-mPEG454抑制LPS诱导的COX-2表达和前列腺素E2的合成姜黄素与NSAIDs均能抑制前列腺素（PGs）合成起到对抗炎症的作用[20]。环氧合酶（COX）是负责将花生四烯酸转化为PGs的关键酶。越来越多的证据表
【参考文献】
相关期刊论文 前4条
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本文编号：2813849
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