莲房原花青素对阿尔兹海默疾病的改善作用及相关机制研究

发布时间：2020-09-21 13:23

　　第一部分莲房原花青素对阿尔兹海默疾病细胞模型的保护作用目的:探索莲房原花青素对阿尔兹海默疾病的保护作用。本研究以β-淀粉样蛋白(Amyloid-β,Aβ)干预大鼠肾上腺嗜铬瘤细胞(Pheochromocytomacells 12,PC12)构建阿尔兹海默疾病(Alzheimer's disease,AD)细胞模型,再通过莲房原花青素(Procyanidins from the lotus seedpod,LSPC)干预AD细胞模型探索LSPC对于AD细胞模型的保护作用。方法:(1)Aβ干预时间以及剂量的确定将PC12细胞接种于96孔板,将0、5、10、20及40μM不同浓度Aβ25-35,按照6、12、24、48、72h不同干预时间分别干预细胞,将0μMAβ25-35组设置为对照组。通过CCK-8实验求得细胞存活率,根据细胞存活率选择最合适的Aβ干预时间以及剂量。(2)LSPC干预剂量的确定确定Aβ干预时间以及剂量后,再通过CCK-8实验确定LSPC干预剂量。将PC12细胞接种于96孔板,将1、2.5、5、10、20及40μg/mL不同浓度的LSPC加入细胞中,预处理30min后加入Aβ25-35,并设置空白对照组和Aβ组。通过CCK-8实验求得细胞存活率,根据细胞存活率确定LSPC干预剂量。(3)莲房原花青素对AD细胞模型的保护作用将PC12细胞分为3组:对照组、Aβ组(20μMAβ干预PC12细胞24h)以及LSPC干预组(10μg/mL LSPC预处理PC12细胞30 min后用20μM Aβ干预PC12细胞24h)。干预完成后,通过倒置显微镜观察和Hoechst染色观察细胞形态学变化;然后使用流式细胞术检测细胞凋亡率,以观察LSPC对AD细胞模型的保护作用。结果:(1)根据CCK-8实验结果显示在5μM Aβ25-35对细胞存活率无显著影响,10μMAβ25-35作用下干预时间越长细胞存活率越低;20μMAβ25-35作用24h后,细胞存活率出现明显下降(P0.05),之后细胞存活率不随干预时间增加而下降;而40μM Aβ25-35干预12 h后细胞存活率一直低于50%。因此选用20μM作为Aβ暴露剂量,24 h作为Aβ干预时间。(2)由20μM Aβ干预引起的细胞凋亡在LSPC剂量由低到10μg/mL.的过程中逐渐降低,当LSPC到达10μg/mL时,细胞存活率显著增加(0.05),且PC12细胞存活率此后不再随LSPC剂量增加而明显增加。结果表明10μg/mLLSPC对AD细胞模型保护效果明显,因此选择10μg/mL作为LSPC的干预剂量。(3)倒置显微镜下Aβ组细胞数目明显减少,细胞形态变化明显,而对照组和LSPC组结果相似。Hoechst染色显示Aβ组可见大量凋亡细胞和核固缩现象,而LSPC组处理后凋亡细胞数量减少,核固缩现象亦减少。流式细胞术结果显示对照组总凋亡率(Q2+Q3)5%,Aβ组细胞总凋亡率达到33.36%(P0.05),而LSPC组比Aβ组细胞凋亡率显著降低(P0.05)。结论:LSPC可改善AD细胞模型中的细胞形态改变及细胞凋亡现象,说明LSPC对于AD具有保护作用。第二部分莲房原花青素在动物体内的代谢分布目的:通过LC-MS/MS探索LSPC在动物体内的代谢及分布,以发现LSPC中对AD起到保护作用的有效成分。方法:(1)实验动物的喂养将SPF级3月龄的SD大鼠一共14只,分为2组,每组7只,喂养2周。对照组每天根据大鼠体重灌胃1mL/kg生理盐水,莲房原花青素干预组每天根据体重200 mg/kg灌胃20 mg/mL的LSPC溶液。第14 d大鼠断头后,分离并保留各组织和血浆。LC-MS/MS实验前,称取60 mg冻存组织样本溶于匀浆器中,充分匀浆并放置-80℃保存,至测试时取出。(2)实验样本准备将标准品配制浓度梯度为0.5、1、2、5、10、20、40、50、80、100ng/mL的标准曲线。将样本取出50μL加入50μLβ-葡萄糖醛酸酶溶液(1500U/mL),pH调节至5,震荡30 s,37℃水浴2 h。向样本加入20μL内标溶液,再加入300μL乙酸乙酯溶液,震荡离心后,取出上清液放入另一 EP管中,再向剩余溶液中加入300μL乙酸乙酯溶液,并重复以上步骤。上清液放置在35℃空干燥,加入50μL复溶液,并在室温下静置后离心。将EP管中45μL上清溶液取出放入测试瓶中以备测定。(3)LC-MS/MS实验条件我们使用液相色谱质谱联用分析仪(LC-MS/MS,AB Sciex Q-Traβ 4500,Applied Biosystems,FosterCity,CA,USA)进行样品分析。流动相由水相(A)0.2%(v/v)乙酸/水,以及有机相(B)0.2%(v/v)乙酸/甲醇组成,进样量为5μL。质谱离子源采用电离子喷雾(electrospray ionization,ESI)源,采用负离子检测模式,并通过LC-MS/MS对各物质母离子子离子对、碰撞能等进行了筛选。然后使用质谱多反应检测(Multiple reaction monitoring,MRM)模式对各种物质进行扫描和定性,并通过标准曲线对物质进行定量分析。结果:(1)在脑组织中对比于对照组动物,LSPC组动物海马中槲皮素(P0.01)、表儿茶素(P0.001)、香草酸(P0.05)、对羟基苯丙酸(P0.05)、没食子酸(P0.01)、3-羟基苯乙酸(3-Hydroxyphenylacetic acid,3-HPAA)(P0.05)均有显著增加。而槲皮素(P0.01)、表儿茶素(P0.001)、香草酸(P0.05)、对羟基苯丙酸(P0.05)、阿魏酸(P0.05)、咖啡酸(P0.01)、间香豆酸(P0.001)、3,4-二羟基苯甲酸(P0.001)在LSPC组皮质中显著增加。对比对照组与LSPC组动物小脑后,发现槲皮素(P0.01)、没食子酸(P0.05)、对羟基苯丙酸(P0.001)、间香豆酸(P0.05)、3-羟基苯乙酸(P0.01)、间羟基苯甲酸(3-Hydroxybenzonic acid,3-HBA)(P0.05)在 LSPC 组中增加明显。(2)LSPC组动物肝脏和心脏组织中,槲皮素、表儿茶素、咖啡酸和3-羟基苯乙酸均有显著增加(P0.05);儿茶素在心脏组织中增加;肝脏组织中3-羟基-4-甲氧基苯乙酸(Homovanillicacid,HVA)、没食子酸、间羟基苯甲酸增加显著(P0.05)。在肾脏组织中槲皮素(P0.001),儿茶素(P0.01),表儿茶素(P0.001),HVA(P0.001),咖啡酸(P0.01),香草酸(P0.05),3,4-二羟基苯乙酸(3,4-Dihydroxyphenylaceticacid,3,4-DHPA)(P0.01),3-HBA(P0.001)和邻苯二酚(0.01)显著增加。LSPC组动物胰腺中槲皮素(0.001),阿魏酸(P0.05),没食子酸(P0.05)和间香豆酸(P0.01)增加显著。槲皮素(P0.05)和3,4-DHPA(P0.01)在LSPC组脾脏中检出显著增加。而在肠道内容物中,除阿魏酸外,各物质均有增加。(3)对比对照组,LSPC组动物血浆中槲皮素(P0.05)、表儿茶素(P0.05)、丁香酸(P0.001)、阿魏酸(P0.01)、HVA(P0.001)、咖啡酸(0.01)、香草酸(P0.001)、p-HPPA(P0.001)、间香豆酸(P0.05)、PCC(P0.01)、3-HBA(P0.001)、邻苯二酚(P0.01)均显著增加。结论:LSPC干预后多种成分在动物体内增加,且不同组织和血浆中的物质含量和形式各不相同。而LSPC干预后槲皮素在体内各个组织中的增加是由于LSPC中槲皮素葡萄糖酸苷(Quercetin-3-O-glucuronide,Q3G)所致。结合本研究结果及已有关于Q3G生物作用的研究报道,因此推测Q3G可能是LSPC对AD起保护作用的有效成分。第三部分莲房原花青素对阿尔兹海默疾病的改善作用及相关机制研究目的:本研究第三部分研究主要是通过AD动物模型验证LSPC中Q3G是否具有改善AD动物学习和记忆能力,并探索Q3G作用的主要通路。方法:(1)将36只C57小鼠分为三组,分别为对照组、AD组及干预组,每组各12只。三组通过侧脑室立体定位分别注射生理盐水、老化Aβ1-42以及老化Aβ1-42。术后对照组和AD组小鼠每天按照20μg/mL体重给予双蒸水,而干预组小鼠每天按照50 mg/kg体重给予用双蒸水溶解的Q3G悬浊液,灌胃30 d,并记录小鼠体重和进食量。(2)小鼠禁食6 h后进行腹腔注射糖耐量测试,并于1周后进行腹腔注射胰岛素耐量测试。干预结束后,小鼠先进行为期各1d的旷场实验和十字高架,之后进行为期7d的水迷宫实验,测定小鼠学习和记忆能力情况。实验结束后,将小鼠处死并分离保存小鼠海马及皮层。(3)通过ELISA分别测定小鼠脑组织Aβ含量以及腹腔注射糖耐量实验收集血浆中胰岛素含量。通过HE染色鉴别小鼠脑组织内细胞坏死和细胞凋亡的情况。通过免疫印迹的方法来检测小鼠脑组织内各蛋白含量及磷酸化情况,并结合免疫组化对相关蛋白进行定位、定性及定量研究。结果:(1)水迷宫实验结果显示AD组小鼠比对照组学习和记忆能力显著降低(P0.05),而干预组小鼠明显改善小鼠的学习和记忆能力(P0.05)。旷场实验及十字高架实验证明Aβ及干预Q3G并未导致小鼠自发活动和焦虑样情绪的改变。(2)腹腔注射糖耐量测试结果表明AD组小鼠血糖代谢与对照组组小鼠有显著差异(P0.05),Q3G可改善Aβ引起的小鼠胰岛素抵抗状态(P0.05)。但是腹腔注射胰岛素耐量测试中三组在胰岛素分泌并无差异,且腹腔注射胰岛素耐量测试三组间亦无明显差异。(3)ELISA以及免疫组化结果显示AD组小鼠比对照组小鼠脑组织内Aβ含量明显增加(P0.05),而Q3G可显著降低Aβ在脑组织内含量(P0.05)。HE染色结果表明AD组脑组织内细胞坏死和凋亡比对照组显著增加,而Q3G可缓解由Aβ引起的细胞坏死和凋亡。免疫印迹和免疫组化发现,与对照组相比,AD组Tau蛋白磷酸化水平显著升高,PKR及JNK蛋白磷酸化显著增多,IRS-1丝氨酸化增加,Akt和ERK磷酸化降低,且GSK蛋白磷酸化水平下降。而Q3G可改善由Aβ导致的小鼠脑组织内胰岛素抵抗,通过降低PKR及JNK蛋白磷酸化水平,减少IRS-1丝氨酸化,提升Akt和ERK磷酸化水平,从而增加GSK蛋白磷酸化水平,降低Tau磷酸化水平。结论:LSPC中Q3G可通过改善AD模型小鼠胰岛素抵抗,调节IRS-1丝氨酸化,从而提高小鼠的学习和记忆能力,因此Q3G可能是LSPC中改善阿尔兹海默疾病的有效成分。本研究为预防与治疗提供新的思路和方案。
【学位单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R285.5

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