葱白提取物单体硫化物S1抗心肌缺血再灌注损伤及其机制研究

发布时间：2020-09-25 09:07

　　 目的:以大鼠心肌细胞H9C2细胞为研究对象,从细胞水平构建缺氧复氧损伤模型,模拟心脏MIRI。通过葱白提取物单体硫化物二丙基二硫(S1),对缺氧复氧模型细胞进行预处理,观察检测内质网应激及细胞凋亡相关指标的变化,探讨葱白提取物单体硫化物S1在内质网应激诱导的H9C2细胞凋亡途径中的作用机制。方法:培养大鼠H9C2心肌细胞,随机分组为7组,采用MTT法在24h下检测正常对照组(con组)、溶剂对照组(0.1%DMSO)、不同浓度的S1处理组(1μg/ml,10μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、1000μg/ml)H9C2细胞活性;制备模型:将H9C2细胞随机分为4组,正常对照组(con组)、缺氧4h复氧0h(4h/0h)、缺氧4h复氧4h(4h/4h)、缺氧4h复氧16h(4h/16h),通过Western blot检测内质网应激标志蛋白GRP78表达情况,确定缺氧复氧诱导H9C2细胞发生内质网应激的时间,构建H9C2细胞缺氧复氧损伤模型;根据前期结果将H9C2心肌细胞随机分为5组,正常对照组(con组)、不同浓度(10μg/ml、50μg/ml、100μg/ml)S1预处理30min后的缺氧复氧组、缺氧复氧组(H/R组)。Annexin V-FITC/PI双染色和流式细胞计数仪检测各组H9C2细胞凋亡情况。荧光定量PCR和Western blot检测胞内相关蛋白GRP78,CHOP,caspase-3、Bcl-2表达情况。结果:1.MTT结果显示:葱白提取物单体硫化物S1的浓度为10μg/ml、50μg/ml、100μg/ml能促进细胞增殖(P0.01),S1浓度为1000μg/ml时对细胞有毒性作用(P0.01),低浓度溶剂(0.1%DMSO)及S1浓度为1μg/ml对细胞无明显影响(P0.05);2.缺氧复氧H9C2细胞损伤模型条件:与con组比,细胞缺氧4h,复氧0h、16h后,GRP78的表达差异无统计学差异。(P0.05)。在缺氧4h复氧4h时,GRP78上调结果显著(P0.05),由此确立诱导H9C2细胞发生内质网应激的缺氧复氧模型;10-1000μg/ml范围内,细胞存活率明显升高,细胞凋亡率明显下降。3.Annexin V-FITC/PI双染色和流式细胞计数仪检测:经过S1预处理后,在4.荧光定量PCR和Western blot检测:内质网应激凋亡通路相关蛋白GRP78、CHOP、caspase-3表达量较H/R组明显下降,而抗凋亡蛋白Bcl-2明显上调(P0.05)。结论:1.葱白提取物单体硫化物S1在10-100μg/ml浓度范围内可促进H9C2细胞增殖,呈浓度依赖性。2.缺氧复氧损伤能使心肌细胞存活率显著性降低,细胞凋亡率明显增高,经葱白提取物单体硫化物S1预处理,可降低细胞凋亡率。3.葱白提取物单体硫化物S1抑制内质网应激诱导的细胞凋亡,可能通过GRP78,CHOP,caspase-3蛋白上调表达、下调Bcl-2蛋白的表达有关。
【学位单位】：湖北民族大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R285.5
【部分图文】：

湖北民族大学硕士学位论文22如图3-1所示，与正常对照组（con）对比，溶剂对照组（0.1%DMSO）与浓度为1μg/ml时，对细胞存活率没有影响，并且无统计学差异，说明低浓度的溶剂与药物对细胞无明显毒性作用。当浓度大于10μg/ml时，细胞存活率与浓度呈正相关性，且都高于con组，差异有显著统计学意义（P＜0.01）。当浓度为1000μg/ml时，与con组相比

第二章 实验研究23图3-2 不同复氧时间对H9C2细胞GRP78蛋白表达的影响Fig.3-2 Effects of different reoxygenation time on GRP78 protein expression in H9C2 cells注：*表示与空白对照组相比较，*：P＜0.055.3 Annexin V-FITC 法流式细胞仪检测H9C2 心肌细胞凋亡细胞接种于培养皿，细胞融合度达70%时饥饿处理，分别用不同浓度S1预处理30min后通过FITC和PI相结合，其检测结果如下图3-3所示。本实验主要分析早期凋亡细胞，从而计算凋亡率。如图3-4所示，con组凋亡率为（5.13±0.42）%、H/R 组凋亡率为（22.30±2.16）%，不同浓度S1预处理组凋亡率分别为（12.0±0.10）%

24100μg/ml con图3-3 流式细胞仪上各组细胞凋亡情况Fig. 3-3 Cell apoptosis in each group on flow cytometry图3-4 Annexin V-FITC 流式细胞仪检测各组凋亡率Fig. 3-4 Annexin V-FITC flow cytometry to detect apoptotic rate in each group注：*表示与空白对照组相比较，**：P＜0.01▲表示与H/R模型组相比较，▲▲：P＜0.015.4荧光定量PCR 检测内质网应激相关蛋白GRP78、CHOP、caspase-3 、Bcl-2基因表达5.4.1 荧光定量PCR测定内质网应激标志蛋白分子GRP78 的mRNA表达本实验以β-actin为内参，通过使用2-ΔΔCT计算结果表明，对比con组，H/R 组和SI预处理组的GRP78mRNA的表达均有明显上调，H/R是con组的2.66±0

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本文编号：2826526