解毒益智方对AD转基因线虫神经保护及Aβ肽聚集作用影响的研究

发布时间：2020-09-27 11:29

　　目的:通过解毒益智方的主药黄连的提取物——黄连多糖对阿尔茨海默病线虫模型的作用,观察黄连多糖对线虫模型神经保护及Aβ肽聚集作用的影响,为解毒益智方在临床治疗AD提供有力的理论依据。方法:以课题组制备的解毒益智方冻干粉为基础实验原料提取黄连多糖,以超声提取法、煮沸提取法和冷浸提取法对实验材料进行黄连多糖的提取,考察最佳提取条件,获得纯度较高的黄连多糖提取物,进而制备阿尔茨海默病转基因线虫模型,对实验模型添加黄连多糖提取物,其中对照组(含黄连多糖0mg/L)、低剂量组(含黄连多糖25mg/L)、中剂量组(含黄连多糖50mg/L)、高剂量组(含黄连多糖100mg/L),考察不同浓度的黄连多糖对线虫寿命、神经保护以及Aβ肽聚集作用的影响。结果:1.以解毒益智方为原料提取黄连多糖,确定超声提取法提取黄连多糖的得率为39.4%,煮沸提取法提取黄连多糖的得率为42.7%,冷浸提取法提取黄连多糖的得率为22.8%。2.黄连多糖对线虫寿命的影响实验表明,在2d时,对照组平均存活率为22.2-28.6%,25mg/L实验组平均存活率为63.0-72.3%,50mg/L实验组平均存活率为48.9-62.5%,100mg/L实验组平均存活率为59.3-72.03%。在5d时,对照组平均存活率仅为5.6-10.2%,25mg/L实验组平均存活率仅为13.0-29.8%,50mg/L实验组平均存活率仅为13.3-18.8%,100mg/L实验组平均存活率仅为26.0-28.8%,与25mg/L实验组线虫寿命水平相近。3.以相同的实验分组及给药浓度的条件下对线虫模型进行瘫痪率实验,从线虫接种至36h,线虫未瘫痪率各实验组均高于90%,从36-60h,线虫瘫痪率明显增多,至实验60h时,25mg/L组线虫未瘫痪率为50.0%,50mg/L组线虫未瘫痪率为56.7%,100mg/L组线虫未瘫痪率为65.9%,从60-92h,受试线虫瘫痪率下降更加明显,至92h,各实验组线虫基本完全瘫痪,但其中100mg/L实验组仍有6.7%的线虫未发生瘫痪。4.不同浓度黄连多糖对线虫模型Aβ肽聚集影响的实验结果显示:对照组Aβ肽聚集非常紧密,周身可见染色的蛋白聚集团,25mg/L实验组可以看到零星的空洞,50mg/L实验组可见大块儿荧光染色空洞,比低剂量组空洞明显增多、增大,100mg/L实验组荧光染色空洞现象更加明显,且部分线虫头部几乎不可见荧光染色。裂解线虫后染色测定裂解液荧光强度,显示对照组的荧光强度为0.74±0.08,25mg/L实验组的荧光强度为0.71±0.06,50mg/L实验组的荧光强度为0.58±0.07,100mg/L实验组的荧光强度为0.49±0.05,随着药物浓度的增加,荧光强度逐渐降低。结论:1.黄连多糖以煮沸法提取能够获得更大的得率,最佳提取条件为料液比为1:3,提取温度为100℃,提取时间为20min,提取次数为5次。2.黄连多糖对线虫模型寿命的延长具有明显效果,25-100mg/L药物浓度对线虫寿命的影响没有太大差异。3.黄连多糖实验组对线虫的神经保护作用明显,神经保护的能力在25-100mg/L区间内随着药物浓度的增加而提高。4.25-100mg/L的黄连多糖对AD线虫模型Aβ肽聚集具有显著抑制作用,在实验浓度区间随药物浓度的增加,抑制作用与浓度呈正相关。
【学位单位】：长春中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R285.5
【部分图文】：

黄连,对线,多糖,寿命

图 1 不同浓度黄连多糖对线虫寿命的影响（与对照组相比，*p<0.05）（第一次实验）图 2 不同浓度黄连多糖对线虫寿命的影响（与对照组相比，*p<0.05）（第二次实验）本实验为进一步减少实验误差，该实验在第一次实验结束后再次重复以上实验。在统

黄连,对线,多糖,存活率

18图 2 不同浓度黄连多糖对线虫寿命的影响（与对照组相比，*p<0.05）（第二次实验）本实验为进一步减少实验误差，该实验在第一次实验结束后再次重复以上实验。在统不同给药浓度对线虫寿命影响的同时对比分析两次实验结果的差异。从图中可以看出：次实验中线虫寿命变化趋势相近，说明实验结果较为稳定，对照组在 2d 时，平均存活率 22.2-28.6%，5d 时，平均存活率仅为 5.6-10.2%，随着时间的推移，线虫死亡数量急剧加，相比实验组而言，线虫存活率明显偏低，而 25mg/L 实验组，在 2d 时，平均存活率 63.0-72.3%，5d 时，平均存活率仅为 13.0-29.8%；50mg/L 实验组，在 2d 时，平均存活

黄连,多糖,对线,对照组

率为 48.9-62.5%，5d 时，平均存活率仅为 13.3-18.8%，略低于 25mg/L 实验组，明显高于对照组；100mg/L 实验组，在 2d 时，平均存活率为 59.3-72.03%，5d 时，平均存活率仅为26.0-28.8%，与 25mg/L 组线虫寿命水平相近。由此可以确定，黄连多糖对线虫模型的寿命具有明显影响，对线虫寿命的延长具有明显效果，25-100mg/L 药物浓度对线虫寿命的影响没有太大差异。6.3 黄连多糖对线虫瘫痪率影响以阿尔茨海默病转基因线虫为实验对象，将实验组分为对照组（含黄连多糖 0mg/L）、低剂量组（含黄连多糖 25mg/L）、中剂量组（含黄连多糖 50mg/L）、高剂量组（含黄连多糖 100mg/L），随机挑选同期化线虫至个实验组中，每个实验平板挑选 30-50 只线虫，经25℃恒温培养箱中进行诱导培养，自接种后每 2h 观察一次线虫瘫痪情况，瘫痪线虫为神经损伤线虫模型，对线虫瘫痪情况进行统计，结果见图 3、4 所示：

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