16个产地地乌药材的系统鉴定及质量评价
发布时间：2022-01-25 11:16
目的:构建地乌药材基原物种系统鉴定体系,并对全国16个产地的地乌药材进行综合品质评价,为地乌药材产地选择及临床用药安全奠定基础。方法:使用传统鉴别方法结合DNA条形码核糖体DNA第二内部转录间隔区（ITS2）序列分子鉴定技术快速鉴别地乌药材真伪,并基于HPLC-UV对地乌药材中5个有效成分进行含量测定,采用Welch Ultimate XB-C18色谱柱（4.6 mm×250 mm,5μm）,流动相乙腈-0.01%三氟乙酸溶液（30∶70）,检测波长210 nm,柱温30℃,流速1.0 mL·min-1。结果:传统鉴别及DNA条形码快速鉴别技术均能准确鉴别地乌药材真伪。BLAST比对分析发现,16个产地地乌药材均与林荫银莲花Anemone flaccida具有最大相似度;基于多指标成分含量测定表明湖北恩施板桥镇的地乌药材中5个三萜皂苷类成分含量之和最高（10.59%）,其次为贵州毕节赫章（6.28%）和湖北长阳都镇湾（5.64%）。结论:DNA条形码技术可作为地乌药材传统鉴定技术的有效补充,该鉴别体系可保障地乌药材基原准确及临床用药安全。HPLC多指标成分综合评价及聚类分析结果表明在本...
【文章来源】：中国实验方剂学杂志. 2020,26(20)北大核心CSCD
【文章页数】：8 页
【部分图文】：
地乌样品信息及性状特征
所有药材样品采用常规的石蜡切片法制片，使用番红-固绿混合染色后，用加拿大树胶封片，在光学显微镜下观察地乌药材横切面，见图2(A）。结果表明其根茎的表皮细胞扁平，外壁厚且木化；皮层薄壁细胞类圆形，为20余列；维管束外韧型，成环分布；髓部大，细胞类圆形。采用粉末制片法制备药材水合氯醛-稀甘油透化装片，在光学显微镜下观察地乌药材粉末，见图2(B）。结果可观察到棕色或黄色的表皮细胞；薄壁细胞常呈破碎状，且细胞壁较厚，呈不均匀的连珠状；非腺毛均为单细胞，其表面可见螺旋状裂隙；导管为梯纹、网纹及螺纹导管；淀粉粒多种。上述结果均与2018年版《湖北省中药材质量标准》[17]中地乌药材显微鉴别特征一致。2.1.3 理化鉴别
采用ITS2通用引物对地乌药材样品基因组总DNA进行PCR扩增[19]。25μL的PCR反应体系：2×Es Taq MasterMix 12.5μL，引物对ITS2(ITS2-2F:5"-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3";ITS2-3R:5"-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3"）各1μL，模板DNA 2μL，灭菌超纯水8.5μL。设置未加模板DNA（以灭菌超纯水代替）的PCR反应为阴性对照。ITS2序列扩增程序为94℃预变性5 min;94℃变性30 s,56℃退火30 s,72℃延伸45 s,35～40个循环；72℃延伸10 min。应用琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，所有样品PCR产物经电泳后均在500 bp处显示单一明亮条带，PCR扩增成功率100%。PCR产物送至生工生物工程（上海）股份有限公司测序，测序成功率100%，经CondonCode Aligner V4.2.4软件去除两端5.8S和28S区段[22]，获得ITS2间隔区序列。经MEGA 7.0软件[23]序列比对分析后，所有样品ITS2序列长度均为211 bp,GC(G表示鸟嘌呤，C表示胞嘧啶）质量分数均为52.6%，共存在1个变异位点，为66位点G-C变异[陕西宝鸡眉县（SBM）]，其主导单倍型序列特征见图3。2.2.3 局部序列比对基本检索工具（BLAST）比对
【参考文献】：
期刊论文
[1]中药DNA条形码分子鉴定技术的应用与展望[J]. 方强强,王燕,彭春,唐玲. 中国实验方剂学杂志. 2018(22)
[2]地乌风湿安胶囊用于类风湿性关节炎Ⅲ期临床研究[J]. 公保吉. 内蒙古中医药. 2017(11)
[3]地乌药材HPLC-UV特征图谱[J]. 杨伟群,范春林,裴红,叶文才,王英. 暨南大学学报(自然科学与医学版). 2016(04)
[4]中药DNA条形码鉴定中的DNA提取方法研究[J]. 罗焜,马培,姚辉,宋经元,陈科力,刘义梅. 世界科学技术(中医药现代化). 2012(02)
[5]药用植物DNA条形码鉴定策略及关键技术分析[J]. 陈士林,宋经元,姚辉,石林春,罗焜,韩建萍. 中国天然药物. 2009(05)
[6]鹅掌草根茎三萜皂苷类成分研究[J]. 韩林涛,黄芳. 中药材. 2009(07)
[7]地乌中的三萜皂苷类成分[J]. 张兰天,高石喜久,张彦文,段宏泉. 中国中药杂志. 2008(14)
[8]环境胁迫下次生代谢产物的积累及道地药材的形成[J]. 黄璐琦,郭兰萍. 中国中药杂志. 2007(04)
[9]地乌总苷对佐剂性关节炎大鼠特异性免疫功能影响的实验研究[J]. 江俊. 中药材. 2002(03)
[10]地乌总甙抗炎及抗过敏作用的实验研究[J]. 江俊,邴飞虹,蒋冠斌. 中药药理与临床. 1996(05)
博士论文
[1]地乌和蛇莓的化学成分研究[D]. 张兰天.天津大学 2007
本文编号：3608438
【文章来源】：中国实验方剂学杂志. 2020,26(20)北大核心CSCD
【文章页数】：8 页
【部分图文】：
地乌样品信息及性状特征
所有药材样品采用常规的石蜡切片法制片，使用番红-固绿混合染色后，用加拿大树胶封片，在光学显微镜下观察地乌药材横切面，见图2(A）。结果表明其根茎的表皮细胞扁平，外壁厚且木化；皮层薄壁细胞类圆形，为20余列；维管束外韧型，成环分布；髓部大，细胞类圆形。采用粉末制片法制备药材水合氯醛-稀甘油透化装片，在光学显微镜下观察地乌药材粉末，见图2(B）。结果可观察到棕色或黄色的表皮细胞；薄壁细胞常呈破碎状，且细胞壁较厚，呈不均匀的连珠状；非腺毛均为单细胞，其表面可见螺旋状裂隙；导管为梯纹、网纹及螺纹导管；淀粉粒多种。上述结果均与2018年版《湖北省中药材质量标准》[17]中地乌药材显微鉴别特征一致。2.1.3 理化鉴别
采用ITS2通用引物对地乌药材样品基因组总DNA进行PCR扩增[19]。25μL的PCR反应体系：2×Es Taq MasterMix 12.5μL，引物对ITS2(ITS2-2F:5"-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3";ITS2-3R:5"-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3"）各1μL，模板DNA 2μL，灭菌超纯水8.5μL。设置未加模板DNA（以灭菌超纯水代替）的PCR反应为阴性对照。ITS2序列扩增程序为94℃预变性5 min;94℃变性30 s,56℃退火30 s,72℃延伸45 s,35～40个循环；72℃延伸10 min。应用琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，所有样品PCR产物经电泳后均在500 bp处显示单一明亮条带，PCR扩增成功率100%。PCR产物送至生工生物工程（上海）股份有限公司测序，测序成功率100%，经CondonCode Aligner V4.2.4软件去除两端5.8S和28S区段[22]，获得ITS2间隔区序列。经MEGA 7.0软件[23]序列比对分析后，所有样品ITS2序列长度均为211 bp,GC(G表示鸟嘌呤，C表示胞嘧啶）质量分数均为52.6%，共存在1个变异位点，为66位点G-C变异[陕西宝鸡眉县（SBM）]，其主导单倍型序列特征见图3。2.2.3 局部序列比对基本检索工具（BLAST）比对
【参考文献】：
期刊论文
[1]中药DNA条形码分子鉴定技术的应用与展望[J]. 方强强,王燕,彭春,唐玲. 中国实验方剂学杂志. 2018(22)
[2]地乌风湿安胶囊用于类风湿性关节炎Ⅲ期临床研究[J]. 公保吉. 内蒙古中医药. 2017(11)
[3]地乌药材HPLC-UV特征图谱[J]. 杨伟群,范春林,裴红,叶文才,王英. 暨南大学学报(自然科学与医学版). 2016(04)
[4]中药DNA条形码鉴定中的DNA提取方法研究[J]. 罗焜,马培,姚辉,宋经元,陈科力,刘义梅. 世界科学技术(中医药现代化). 2012(02)
[5]药用植物DNA条形码鉴定策略及关键技术分析[J]. 陈士林,宋经元,姚辉,石林春,罗焜,韩建萍. 中国天然药物. 2009(05)
[6]鹅掌草根茎三萜皂苷类成分研究[J]. 韩林涛,黄芳. 中药材. 2009(07)
[7]地乌中的三萜皂苷类成分[J]. 张兰天,高石喜久,张彦文,段宏泉. 中国中药杂志. 2008(14)
[8]环境胁迫下次生代谢产物的积累及道地药材的形成[J]. 黄璐琦,郭兰萍. 中国中药杂志. 2007(04)
[9]地乌总苷对佐剂性关节炎大鼠特异性免疫功能影响的实验研究[J]. 江俊. 中药材. 2002(03)
[10]地乌总甙抗炎及抗过敏作用的实验研究[J]. 江俊,邴飞虹,蒋冠斌. 中药药理与临床. 1996(05)
博士论文
[1]地乌和蛇莓的化学成分研究[D]. 张兰天.天津大学 2007
本文编号：3608438
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