基于PI3K/AKT/mTOR信号通路研究补肾活血法调控大鼠卵巢颗粒细胞自噬的分子机制

发布时间：2024-05-19 18:09

　　实验一雷公藤甲素诱导离体原代培养大鼠卵巢颗粒细胞自噬的研究目的:观察雷公藤甲素(triptolide,TP)诱导颗粒细胞(granulosa cells,GCs)自噬所需的浓度、时间和作用机制。方法:1.采用CCK-8法比较不同浓度的TP对原代培养大鼠卵巢GCs的抑制作用并计算IC50;WB法检测不同浓度、时间点下TP对GCs自噬相关因子蛋白表达及PI3K/AKT/mTOR通路级联的影响。2.WB法检测TP、自噬诱导剂(BrefeldinA)、PI3K/mTOR抑制剂(NVP-BEZ235)分别干预GCs对PI3K/AKT/mTOR通路及自噬相关因子蛋白表达的影响。结果:1.不同浓度TP作用于大鼠卵巢GCs的IC50为14.65μM,其中最小抑制浓度为0.1μM(100nM)。2.与空白对照组相比,各组Beclin1、LC3II蛋白表达水平均升高,LC3I及p62蛋白表达水平均下降,其中TP(100nM)作用与大鼠GCs12h,各指标变化显著(p<0.05或p<0.01);3.TP,BrefeldinA,NVP-BEZ235分别处理大鼠GCs12h后,与空白对照组相比,TP...

【文章页数】：139 页

【学位级别】：博士

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中文摘要
ABSTRACT
英文缩略词表
引言
第一部分 理论研究
    一 卵泡发育障碍类疾病的研究现况
    二 颗粒细胞自噬对卵泡发育和闭锁的调控
    三 颗粒细胞自噬与PI3K/AKT/mTOR信号通路
    四 导师治疗卵泡发育障碍类疾病临证经验
第二部分 实验研究
    课题的前期研究基础及创新性
        研究基础
        研究创新点
    实验一 雷公藤甲素诱导离体原代培养大鼠卵巢颗粒细胞自噬的研究
        1 材料与试剂
            1.1 实验动物和实验条件
            1.2 主要药物、试剂和仪器
            1.3 实验分组
        2 实验方法
            2.1 大鼠卵巢颗粒细胞的分离与原代培养
            2.2 离体培养大鼠卵巢颗粒细胞鉴定
            2.3 CCK8法检测TP对GCs增殖的抑制
            2.4 WB法检测各组卵巢GCs中Beclin1、LC3Ⅱ/Ⅰ、P62、p-PI3K，p-AKT及p-mTOR蛋白表达
        3 统计分析
        4 实验结果
            4.1 体外培养大鼠卵巢颗粒细胞形态学观察
            4.2 大鼠卵巢颗粒细胞的鉴定
            4.3 雷公藤甲素对大鼠卵巢颗粒细胞增值的抑制作用
            4.4 雷公藤甲素诱导大鼠卵巢颗粒细胞自噬浓度的确定
            4.5 雷公藤甲素诱导大鼠卵巢颗粒细胞自噬时间的确定
            4.6 大鼠卵巢颗粒细胞自噬诱导剂确定及机制研究
        5 讨论
            5.1 选择颗粒细胞(GCs)作为研究对象的原因
            5.2 采用雷公藤甲素诱导颗粒细胞自噬的原因
            5.3 实验指标的意义与结果分析
        6 结论
    实验二 基于PI3K/AKT/mTOR信号通路研究补肾活血中药复方新加归肾丸对雷公藤甲素致大鼠卵巢颗粒细胞自噬的调控
        1 材料与试剂
            1.1 实验动物和实验条件
            1.2 主要药物
            1.3 主要试剂和仪器
        2 实验方法
            2.1 实验技术路线图
            2.2 大鼠含药血清的制备
            2.3 大鼠卵巢颗粒细胞的TP诱导处理
            2.4 实验分组及添加受试药物处理
            2.5 Elisa法检测颗粒细胞分泌E₂、P含量
            2.6 透射电子显微镜下观察各组自噬小体数量
            2.7 RT-qPCR法检测大鼠卵巢颗粒细胞PI3K、AKT、mTOR及自噬相关因子的mRNA相对表达量
            2.8 WB法检测颗粒细胞中的p-PI3K、p-AKT、p-mTOR及自噬相关因子蛋白表达
            2.9 免疫荧光观察各组颗粒细胞中信号通路及自噬相关因子的表达
        3 统计分析
        4 实验结果
            4.1 药效实验
            4.2 机制实验
        5 讨论
            5.1 补肾活血法治疗卵泡发育障碍类疾病的立法依据
            5.2 补肾活血中药复方新加归肾丸的方药分析
            5.3 阳性对照药物的选择
            5.4 补肾中药复方调控细胞信号转导通路促卵泡发育的实验研究现况
            5.5 调控细胞自噬是中药发挥药理作用的重要机制
            5.6 实验指标意义与结果分析
        6 结论
问题与展望
致谢
参考文献
附件
    综述一 自噬与中医药延缓卵巢衰老的研究进展
        参考文献
    综述二 基于“肾主生殖”理论认识细胞自噬与卵泡发育
        参考文献
    在读期间公开发表的学术论文
    在读期间参加的学术会议



本文编号：3978266