电针刺激联合BMSCs移植治疗对脑出血大鼠脑组织内AQP

发布时间：2016-12-24 12:28

  本文关键词：电针刺激联合BMSCs移植治疗对脑出血大鼠脑组织内AQP-4、AQP-9及MMP-9蛋白表达的影响，由笔耕文化传播整理发布。

《泸州医学院》 2013年

电针刺激联合BMSCs移植治疗对脑出血大鼠脑组织内AQP-4、AQP-9及MMP-9蛋白表达的影响

范光碧  

【摘要】：目的：电针刺激联合骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stemcells, BMSCs)移植治疗脑出血(Intracerebral Hemorrhage, ICH)大鼠，观察出血灶周边脑区脑水肿相关蛋白水通道蛋白4（aquaporins-4，AQP-4）、水通道蛋白9（aquaporins-9， AQP-9）、基质金属蛋白酶9（matrixmetalloproteinase-9，MMP-9）的表达变化，探讨通过联合治疗能否促进脑出血大鼠出血灶周边脑区水转运，减轻脑水肿，改善神经缺失症状。方法：1.建立脑出血大鼠模型：利用脑立体定位仪向SD大鼠右侧尾状核区注射肝素+Ⅰ型胶原酶诱导脑出血模型，于术后2h、24h、48h进行三次神经损害程度评分（Neurological severity score，NSS评分），任意一次评分大于9分者入选实验组。2.培养骨髓间充质干细胞（BMSCs）：将冷冻保存并已作GFP标记的BMSCs进行复苏、传代，当生长至细胞融合度为80%左右时，换预诱导液诱导24h，于移植前6h改用无血清诱导液诱导，移植时收集细胞，调整细胞浓度至2.5×107个/ml用于移植。3.实验动物分组：生理盐水组(Control组)，造模后第3d沿相同手术入路向右侧尾状核区注入生理盐水20μl；细胞移植组(BMSCs组)，造模后第3d往出血灶内移植BMSCs20μl；电针治疗组（electro-acupuncture therapy，Ea组），造模后第3d开始以连续波、频率3Hz、强度1V的电针刺激大鼠百会穴和大椎穴，每天1次直至处死动物；电针刺激联合细胞移植组（electro-acupuncture combinedwith BMSCs transplantation,Ea-BMSCs组），造模后第3天往出血灶移植BMSCs20μl，细胞移植后2h开始电针刺激，之后同电针治疗组处理方法一致。4.按分组后喂养的时间不同将各组动物再分为1d、3d、5d、7d及14d5个亚组，在相应时间点采血，收集血清，处死动物取出脑组织。5.采用免疫组化SABC法观察AQP-4、AQP-9及MMP-9在脑组织中的分布；Western-blotting检测AQP-4在出血灶周边脑区的表达变化；干湿法检测出血灶周边脑组织水含量；放射免疫法（RIA）测定血清中白细胞介素2（Interleukin-2，IL-2）的含量。结果：1.出血灶周边脑组织水含量：①各组模型脑组织水含量在第3d开始升高，第5d达到峰值。②Ea组各时间点脑组织水含量均低于其余各组（p＜0.05）。③Ea-BMSCs组只有5d、7d组脑组织水含量低于Control组（p＜0.05）。④Ea-BMSCs组与BMSCs组之间比较未见统计差异。2.出血灶周边区脑组织AQP-4的表达变化：（1）免疫荧光双标显示，AQP-4阳性物质表达于出血灶周边脑区胶质酸性纤维蛋白（GFAP）阳性细胞上。（2）免疫组化检测出血灶周边脑区AQP-4阳性产物的OD值（平均光密度值）：①Control组、BMSCs组和Ea BMSCs组AQP-4蛋白在第3d开始升高，于第5d达到峰值，BMSCs组和Ea-BMSCs组在第7d后再度升高，而Control组和Ea组在达峰值后未见升高。②Ea-BMSCs组和BMSCs组在第1d、5d蛋白表达均低于Control组（p＜0.05），在第14d表达却高于Control组（p＜0.05），且Ea-BMSCs组第1d、5d的表达低于BMSCs组（p＜0.05），而第14d蛋白的表达与BMSCs组比较无统计学差异。（3）Western-blotting检测出血灶周边AQP-4阳性物质的灰度值：3.出血灶周边区脑组织AQP-9的表达变化：免疫组化检测出血灶周边脑区AQP-9阳性产物OD值显示，①Control组、BMSCs组和Ea-BMSCs组AQP-9蛋白在第1d开始升高，于第3d和7d第两次达到峰值，而Ea组只于第7d达到峰值；②第3d，Ea-BMSCs组AQP-9表达高于Control组、BMSCs组和Ea组（p＜0.05），而BMSCs组与Control组和Ea组之间比较无统计学差异；③第7d，Ea组、Ea-BMSCs组和BMSCs组AQP-9表达均高于Control组（p＜0.05），Ea-BMSCs组AQP-9表达高于Ea组，且具有统计学差异（p＜0.05），但Ea-BMSCs组与BMSCs组之间比较差异无统计学意义。4.出血灶周边区脑组织MMP-9的表达变化：（1）免疫荧光检测可见，MMP-9阳性产物主要表达于出血灶及周边脑区，且随着时间的推移，阳性表达产物逐渐减少。（2）免疫组化检测出血灶周边脑区MMP-9阳性产物OD值显示，①Ea-BMSCs组和BMSCs组MMP-9表达于第1d开始升高，第3d达到峰值，之后缓慢下降，Ea-BMSCs组于第7d开始出现上升的趋势。Control组和Ea组一直呈现缓慢下降的趋势。②在第1d，Ea-BMSCs组和Ea组显著低于BMSCs组和control组（p＜0.05），但Ea-BMSCs组和Ea组之间比较以及BMSCs组和control组之间比较，未见统计学差异。③在第3d，Ea-BMSCs组和Ea组MMP-9表达低于control组（p＜0.05），Ea-BMSCs组高于Ea组（p＜0.05）；BMSCs组高于control组（p＜0.05）。④在第14d，Ea-BMSCs组和BMSCs组MMP-9表达均高于control组（p＜0.05），Ea组低于control组（p＜0.05），但Ea-BMSCs组、BMSCs组组间比较未见统计学差异。5.血清IL-2含量：①在第1d，各组之间含量无差异；②从第3d开始，BMSCs组显著高于其余各组（P＜0.05），而后迅速降低，于第5d与control组相近，随后开始升高。③从第5d开始，Ea-BMSCs组IL-2表达才显著高于control组和BMSCs组（P＜0.05），且该组IL-2的含量一直在较高水平上缓慢下降；④Ea组在第3d与其余各组比较出现显著降低（P＜0.05），但从第5d开始高于移植组和control组（P＜0.05），于第14d显著增高，与其余各组相比，P＜0.05。结论：1.电针联合BMSCs移植可在脑出血急性期抑制AQP-4的表达，减轻局部脑水肿，急性期后可促进AQP-4表达上调，加快水的跨膜转运，促进水肿消散。2.电针联合BMSCs移植可在脑出血后期上调AQP-9的表达，加快脑水肿的消散和促进脑能量代谢的恢复。3.BMSCs移植治疗早期可促进MMP-9的表达，加重脑水肿，BMSCs移植后辅以电针治疗可降低MMP-9的表达，减轻移植排斥反应。4. BMSCs治疗可引起血清IL-2含量显著升高，推测BMSCs移植可能诱发移植物抗宿主反应，采用电针联合BMSCs治疗可降低血清IL-2水平，，减轻移植排斥反应。

【关键词】：
【学位授予单位】：泸州医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R743.34;R245
【目录】：

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本文编号：225444