模拟推拿机械力刺激干预大鼠骨骼肌细胞生物力学效应研究

发布时间：2020-08-12 13:45

【摘要】：推拿手法作为传统中医外治疗法,其本质为机械力学刺激,能产生如压力、张力、摩擦力和剪应力等多种形式的“推拿力”(机械力),在机械力作用下人体组织细胞对机械刺激的反应可能是推拿细胞生物力学原理之一,如何将力学信号转变为各种生化信号是推拿手法机制研究的关键。目前,对手法生物力学原理的研究已由宏观向微观深入,但体内复杂的力学环境因素使体内研究难以区别单一效应或特定的联合效应,基于细胞分析的体外细胞培养技术给这一难题的解决带来转机;机体内的各种力学敏感细胞是手法机械力作用的主要部位和效应靶点;通过文献检索我们发现,目前,已有研究者构建了一些推拿手法相关的骨骼肌细胞体外培养-力学刺激模型,发现不同参数(频率、时间、力)作用下组织细胞的部分力学响应特征,但他们之间的关系未能得到很好的阐述;我们前期工作发现相同手法的不同生物力学参数及其所引发的力学效应存在差异,但是因为何种因素导致这种不同生物力学参数机械力刺激下力学效应的差异?不同生物力学参数机械力刺激下细胞的生物力学效应有何异同?我们仍然认识较浅。目的:构建骨骼肌细胞体外培养-力学刺激模型,模拟推拿机械力刺激,观察恒定压力作用下不同刺激时间以及固定时间不同应力模式、不同强度刺激下大鼠骨骼肌细胞(RSkMCs)生物学力响应特征,探讨推拿手法效应机制。方法:体外培养RSkMCs,采用四点弯曲细胞力学加载系统(FPBS)施加类推拿机械力刺激,观察恒定压力作用下不同时间;及固定时间,不同应力模式、不同强度机械力作用下RSkMCs生物力学效应的变化,采用倒置生物显微镜观察细胞形态及排列变化,流式细胞仪(FCM)分析细胞周期、凋亡及细胞内Ca~(2+)浓度变化,计算细胞S期细胞比例(SPF)及增殖指数(PI)的变化;免疫组织化学(IHC)检测MyOD、Myf5蛋白表达水平的变化;酶联免疫吸附实验(ELIS A)和硝酸还原酶法(NRM)分别检测培养上清液中白介素6(IL-6)、前列腺素E_2(PGE_2)和一氧化氮(NO)浓度的变化;分析各指标之间相关性。结果:1.细胞形态及排列改变与机械力刺激时间、强度及应力模式有关,刺激时间越长、强度越大细胞形态及排列改变越明显;压缩性应力细胞形态趋于类圆形改变,牵张性应力细胞形态趋于梭形改变,交互应力细胞形态及排列改变不明显。2.不同时间、应力模式及强度的机械力对细胞凋亡的影响存在差异,持续压力作用下,细胞凋亡成一定的时间依赖性,时间越长细胞凋亡越明显;固定刺激时间30min,不同模式的应力刺激均可以促进细胞凋亡,持续压力促进细胞凋亡作用强于周期性作用力;轻、中强度的刺激可以抑制细胞凋亡,而重强度的刺激对细胞的凋亡作用与力学性质有关,单一性质压力刺激抑制凋亡,组合交互性质(压缩-牵张/牵张-压缩)刺激促进细胞凋亡。3.机械力可以通过影响SPF而影响细胞增殖,持续压力刺激对肌细胞的SPF及PI呈双向调节作用,短时间(90min)抑制,长时间(120min)促进;刺激时间30min,周期性牵张应力可以显著增加SPF及PI;轻、中、强三种强度刺激均可增加SPF及PI,以轻、重刺激作用明显。4.机械力刺激可以影响肌细胞的分泌,短时间(30min)、轻、中刺激显著提升肌细胞培养上清液中PGE_2和NO浓度及胞内Ca~(2+)浓度,重刺激胞内Ca~(2+)浓度与力学模式有关,组合交互性质(压缩-牵张/牵张-压缩)机械力提升胞内C a~(2+)浓度,单一性质压力无显著影响;力的性质而言,周期性牵张应力可以显著提升肌细胞培养上清液中PGE_2和NO浓度及胞内Ca~(2+)浓度;持续压力、重刺激肌细胞培养上清液中IL-6浓度有降低趋势。5.MyoD、Myf5蛋白的表达与机械力刺激时间、强度、性质有关,持续压力作用,短时间(30min)促进MyoD、Myf5蛋白的表达,但随着时间延长促进作用减弱;刺激时间30min,MyoD、Myf5对周期性作用力敏感;不同强度单一性质压力刺激对MyoD、Myf5蛋白的表达无影响,组合交互性质(压缩-牵张/牵张-压缩)轻、中、强度刺激可以促进MyoD、Myf5蛋白的表达。结论:1.不同时间、应力模式及强度的机械力引发的细胞生物力学效应存在差异,细胞可以通过改变形态、周期、增殖与凋亡、分泌及蛋白的合成等力学组学形式来响应机械力刺激,通过多层次的力学-化学-生物学耦合作用产生生物学效应。2.细胞直接感受机械力刺激并调控生物信号的转导可能是推拿手法发挥局部治疗作用的效应机制之一。3.合理的用力模式及时间、强度是推拿手法发挥治疗效应的关键因素。
【学位授予单位】：成都中医药大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R244.1;R-332
【图文】：

对力学刺激的反应基本上都是以信号传递的方式进行着的[24]于体内外的机械信号通过细胞与细胞之间的即时影响（如胞内械信号转导为一定的电化学信号两种模式在生物体内进行传递的应答和响应（如细胞变形、力敏感型离子通道的激活、力学）方式，产生与之相应的生物学行为改变[17,18,25]。在机械力的通过细胞层次的力学-生物学耦合（增殖、分化、凋亡及对机等）、分子层次的力学-化学耦合（蛋白质、DNA 等生物大分学-化学-生物学耦合作用引起局部效应和整体效应，从而对机调整[19-21,25]，它涉及细胞在力学载荷作用下细胞的各种力学行与凋亡、代谢等一系列改变[26,27]，这种在机械力刺激下于细协同发生作用的过程称为力学组学[20,21]（细胞受到的力学刺激应答，包括转录组学、蛋白组学与系统变化等，图 1B）。A. B.

05个／mL，每孔加入 0.2mL 的细胞悬液体和 0.8mL 的培养基，将细胞接种到 24 孔板，置于 37℃，5%CO2孵箱内培养，培养 48h 后，每天取出 3 个孔的细胞消化后制成单细胞悬液，台盼蓝染色 3min 后显微镜下进行细胞计数，连续 7 日，细胞每 2 天换一次液，根据计数结果使用 GraphPad Prism 软件绘制细胞生长曲线。3 研究结果3.1 细胞形态原代骨骼肌细胞较小，呈圆形或类圆形，折光性较强，随着培养时间的延长肌细胞开始增殖，形态逐渐延展变成梭形或纺锤形，并逐渐趋于融合（图 1-1A）。贴壁细胞呈梭形、纺锤形或多角形，折光性较好（图 1-1B）；随着培养时间延长，细胞增殖并逐渐融合形成肌管（图 1-1C）。A.B. C.

成都中医药大学博士学位论文3.2 细胞鉴定α-骨骼肌肌动蛋白(α-Sarcometric Actin，α-SCA) 是骨骼肌特有的结构和功能蛋白[68]，通过对α-SCA免疫细胞化学染色可以与其它细胞鉴别。本实验采用α-SCA单克隆抗体进行细胞免疫荧光染色，结果显示 90%以上的细胞呈阳性（即肌细胞纯度达 90%以上）胞浆染成红色（图 1-2A和B），细胞核为蓝色（图 1-2C），其他非骨骼肌细胞呈阴性；说明所培养的细胞为骨骼肌细胞。A. B.C.

【相似文献】

相关期刊论文 前10条

1 郝宏党;李永明;;透射电镜明暗场细胞超微结构的互换观察[J];电子显微学报;1987年03期

2 周宁新;蒋彦永;温赞铭;;高温与辐射对人胃癌细胞系(SGC-7901)的生物效应 Ⅱ 细胞超微结构的动态变化[J];中国人民解放军军医进修学院学报;1987年01期

3 ;国外文摘[J];核农学通报;1987年01期

4 周宁新;朱光明;侯宁;;人胃癌细胞系分裂行为在加温与辐射后的不同变化—M期细胞超微结构的动态观察[J];细胞生物学杂志;1987年01期

5 张凌志;韩维廉;;鸡血液淋巴细胞和胸腺腔上囊淋巴细胞超微结构的比较[J];中国畜禽传染病;1987年03期

6 ;免疫学[J];中国医学文摘(基础医学);1988年02期

7 庞仁博;现代医学对血淤症本质的认识[J];重庆医药;1988年03期

8 赵晓俊;樊廷玉;王秀玲;郭世宜;梁树林;张兆慧;;缺钙对白菜根尖细胞超微结构和ATP酶活性的影响[J];电子显微学报;1988年03期

9 张瑞祥;赵淑敏;李春辉;刘胜;卢金秀;张英;王宇;陈文秀;翟亚力;张淑英;赵晓明;;人妊娠滋养细胞超微结构动态研究(摘要)[J];承德医学院学报;1988年03期

10 方永强,齐襄;文昌鱼哈氏窝上皮细胞超微结构的研究[J];中国科学(B辑 化学 生命科学 地学);1989年06期

相关会议论文 前10条

1 刘冰;周忠良;;镉对弹涂鱼肝细胞超微结构影响的初步观察[A];2006年上海市动物学会学术年会论文集[C];2006年

2 王学斌;杨兴易;林兆奋;赵良;周乃胜;;贝科能对心肺复苏后大鼠心、脑、肾细胞超微结构的保护作用[A];第十一次全国急诊医学学术会议暨中华医学会急诊医学分会成立二十周年庆典论文汇编[C];2006年

3 陈细法;;免疫抑制剂对浆细胞超微结构和功能影响的观察[A];海峡两岸电子显微学研讨会论文专集[C];1992年

4 沈留成;;阳萎患者阴茎海绵体平滑肌细胞超微结构的研究[A];新编男科理论与临床——中华中医药学会第七届中医男科学术大会;全国中医男科临床与科研方法高级研修班;2006年云南省中医男科诊疗技术培训班讲义与论文集[C];2006年

5 姜巧珍;王宇一;其木格;;人肾旁神经节小强荧光(SIF)细胞超微结构观察[A];第二届全国扫描电子显微学会议论文集[C];2001年

6 徐剑文;王玮;康仲涵;张更;周琳瑛;;低氧对小鼠星形胶质细胞超微结构的影响[A];解剖学杂志——中国解剖学会2002年年会文摘汇编[C];2002年

7 黄巨恩;李校坤;杨志平;梁祖鼎;;bFGF对庆大霉素肾毒性的防治研究中细胞超微结构的改变[A];解剖学杂志——中国解剖学会2002年年会文摘汇编[C];2002年

8 刘健;范海霞;杨梅云;余学芳;;佐剂关节炎大鼠行为、脑组织氨基酸及神经细胞超微结构的变化及新风胶囊对其的影响[A];全国第七届中西医结合风湿病学术会议论文汇编[C];2008年

9 谢宝生;贺亮;黄伟芬;吴斌;由广兴;路盛强;;+Gx作用对大鼠脑组织能量代谢和脑皮层细胞超微结构的影响[A];中国宇航学会航天医学工程专业委员会、中国空间科学学会空间生命专业委员会联合学术研讨会论文摘要集[C];2001年

10 刘玉梅;邓雯;吕琼霞;陈晓光;;柠檬酸对HepG2细胞超微结构的影响[A];全国动物生理生化第七届全国代表大会暨第十三次学术交流会论文摘要汇编[C];2014年

相关博士学位论文 前10条

1 卢群文;模拟推拿机械力刺激干预大鼠骨骼肌细胞生物力学效应研究[D];成都中医药大学;2019年

2 王籽橙;FKBP12在细胞程序性坏死及其介导的全身炎症反应综合征中的调控作用研究[D];军事科学院;2019年

3 宋英;缺血性及兴奋性氨基酸损伤诱导PC12细胞5-脂氧酶激活及米诺环素的保护作用[D];浙江大学;2005年

4 陈强;血小板衍化生长因子对牙髓和牙周组织细胞生物学作用的基础研究[D];第四军医大学;1996年

5 石英爱;RNA干涉HeLa细胞端粒酶对其细胞生物学行为的影响及其作用机制的研究[D];吉林大学;2007年

6 郭辉;姜黄素对雄激素依赖性及雄激素非依赖性前列腺癌细胞的诱导凋亡作用[D];华中科技大学;2006年

7 叶韵斌;Grb2抑制剂peptidimer-c抗K_（562）细胞的实验研究[D];福建医科大学;2007年

8 张金平;外源表达Nkx2-5基因诱导P19细胞心肌分化[D];河北医科大学;2008年

9 肖祥希;龙眼（Dimocarpus Longana Lour.）对铝胁迫的生理化反应及其矫治[D];福建农林大学;2002年

10 郝燕燕;苹果果实日烧发生机理及果皮抗光氧化特性的研究[D];中国农业大学;2004年

相关硕士学位论文 前10条

1 贾瑞星;镉胁迫下两个红麻品种形态、生理响应及差异基因发掘[D];广西大学;2019年

2 燕群;高分化肝癌组织来源的人工肝细胞材料的构建及生物学特性检测[D];南方医科大学;2013年

3 李圆圆;采前CPPU处理对猕猴桃采后品质及细胞超微结构的影响机制研究[D];西北农林科技大学;2018年

4 邓明芬;7-硝基吲唑拮抗过量氟暴露引起的SH-SY5Y细胞NO/NOS表达水平升高及毒性作用[D];贵州医科大学;2017年

5 闫娈;Ins2细胞世系的追踪及相关表达研究[D];重庆医科大学;2017年

6 李春春;砷致细胞恶性转化过程中转录因子Nrf2对细胞凋亡的作用[D];苏州大学;2017年

7 刘晓晖;温度和铜对鲤鱼肝脏细胞超微结构的影响[D];东北师范大学;2006年

8 齐开杰;钙胁迫对‘爱宕’、‘喜水’梨幼苗生理和细胞超微结构的影响[D];南京农业大学;2009年

9 桂明才;慢性间歇性缺氧对大鼠血糖及其胰岛B细胞超微结构的影响[D];重庆医科大学;2010年

10 邹玲悦;ROS在硫酸镍致大鼠Leydig细胞睾酮合成障碍中的作用[D];兰州大学;2017年

本文编号：2790613