艾灸对AA大鼠“足三里”穴位局部与氧化磷酸化相关基因表达的影响

发布时间：2017-04-30 16:08

  本文关键词：艾灸对AA大鼠“足三里”穴位局部与氧化磷酸化相关基因表达的影响，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的： 采用全基因表达谱芯片和生物信息学分析技术,挖掘氧化磷酸化信号通路对艾灸刺激响应的潜在分子靶点,运用实时荧光定量聚合酶链式反应对潜在分子靶点进行生物学验证,从氧化磷酸化的角度为穴位局部对艾灸刺激响应的研究提供线索。 方法： (1)艾灸后“足三里”穴位局部氧化磷酸化信号通路及相关基因挖掘：将24只SD大鼠随机分为空白组、模型组、温和灸组、隔附灸组。模型组、温和灸组、隔附灸组大鼠分别给予局部注射弗氏完全佐剂诱导佐剂性关节炎模型,造模后第7天,温和灸组在“足三里”穴给予温和灸15分钟,隔附灸组在“足三里”穴给予隔附灸5壮。灸后2个小时,立即取各组大鼠“足三里”穴位局部组织,提取并纯化组织总RNA,用改良的cRNA反转录线性扩增法对实验样品和共同参照样品进行荧光标记,用27k大鼠全基因表达谱芯片进行杂交扫描,检测“足三里”穴位局部对艾灸刺激响应的基因表达谱,用微阵列显著性检验软件(SAM)分别筛选温和灸组、隔附灸组相对于模型组的差异基因表达谱,运用随机方差模型筛选共表达差异基因,用分子功能注释系统(MAS)对共表达差异基因进行信号通路分析和相关基因挖掘。(2)生物学重复验证实验：以SD大鼠为研究对象,动物实验的方法和操作完全和表达谱芯片实验的一致,提取组织总RNA后,用实时荧光定量聚合酶链式反应对艾灸后佐剂性关节炎大鼠“足三里”穴位局部氧化磷酸化信号通路的潜在分子靶点进行验证。 结果： 1.温和灸后“足三里”穴位局部差异表达基因共筛选出498个,上调基因255个下调基因243个。隔附灸后“足三里”穴位局部差异表达基因共筛选出937个上调基因335个,下调基因602个。“足三里”穴位局部对温和灸和隔附灸刺激响应的共表达差异基因筛选出106个,上调基因44个,下调基因62个。筛选出共表达差异基因富集的信号通路27个(P0.001),其中氧化磷酸化信号通路中的参与基因分别是Cox7a2、Atp6v0d2、Atp5j。(以foldchange≥2.0|Score(d)|≥2和foldchange0.5|Score(d)|2分别作为上调基因和下调基因的筛选标准)。 2.生物学重复验证实验结果：Cox7a2、Atp6v0d2、Atp5j的表达水平：模型组与空白组相比,三个基因均显著下调(P0.05)；温和灸组与模型组相比,三个基因均显著上调(P0.05),与芯片结果一致；隔附灸组与模型组相比,三个基因均显著上调(P0.05),与芯片结果一致；与温和灸相比,隔附灸对三个基因的上调作用更明显(P0.05),与芯片结果一致。 结论： 氧化磷酸化信号通路可能参与穴位局部对艾灸刺激的应答,Cox7a2、 Atp6vOd2、Atp5j可能是艾灸对穴位局部氧化磷酸化信号通路影响的潜在分子靶点。
【关键词】：艾灸 氧化磷酸化作用 Cox7a2 Atp6v0d2 Atp5j 基因表达谱 实时荧光定量聚合酶链式反应
【学位授予单位】：成都中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R245.81
【目录】：

• 中文摘要2-4
• ABSTRACT4-8
• 缩略词表8-9
• 前言9-11
• 实验研究11-44
• 第一部分 艾灸后“足三里”穴位局部氧化磷酸化信号通路及其分子靶点的挖掘11-38
• 1 实验材料11-14
• 1.1 实验动物11
• 1.2 主要试剂盒11-12
• 1.3 主要仪器12-13
• 1.4 使用软件13-14
• 2 实验方法14-20
• 2.1 动物分组与造模14
• 2.2 艾灸干预和样本取材14
• 2.3 RNA提取和质检14-16
• 2.3.1 RNA提取14-15
• 2.3.2 RNA质检15
• 2.3.3 RNA纯化15-16
• 2.4 RNA荧光标记16-18
• 2.4.1 合成1st-strand cDNA16
• 2.4.2 合成2nd-strand cDNA16
• 2.4.3 体外转录合成cRNA16-17
• 2.4.4 反转录合成cDNA17
• 2.4.5 荧光标记反应17-18
• 2.5 杂交前芯片预处理和芯片杂交18-19
• 2.5.1 杂交前处理18
• 2.5.2 芯片杂交18-19
• 2.6 芯片清洗19
• 2.7 芯片扫描19
• 2.8 芯片数据分析19-20
• 2.9 对差异基因进行信号通路筛选20
• 3 结果和分析20-38
• 3.1 动物总体情况观察和足趾容积检测20-21
• 3.2 差异基因筛选21-33
• 3.2.1 温和灸组与模型组相比筛选出的差异基因21-25
• 3.2.2 隔附灸组与模型组相比筛选出的差异基因25-33
• 3.3 “足三里”穴位局部对温和灸和隔附灸刺激响应的的共表达差异基因筛选33-36
• 3.3.1 “足三里”穴位对温和灸和隔附灸刺激响应的共同上调基因33-34
• 3.3.2 “足三里”穴位对温和灸和隔附灸刺激响应的共同下调基因34-36
• 3.4 “足三里”穴位局部对温和灸和隔附灸刺激响应共表达差异基因信号通路筛选36-38
• 第二部分 艾灸后“足三里”穴位局部氧化磷酸化信号通路相关基因的生物学重复实验38-44
• 1 材料和方法38-41
• 1.1 实验动物38
• 1.2 主要试剂、仪器及耗材38
• 1.3 动物分组与造模方法38
• 1.4 艾灸干预与取材38
• 1.5 RNA提取38-39
• 1.6 RNA质检39
• 1.7 实时荧光定量聚合酶链式反应步骤39-40
• 1.7.1 基因的引物设计39
• 1.7.2 以RNA为模板合成cDNA39
• 1.7.3 退火温度39-40
• 1.7.4 各基因的qPCR反应程序40
• 1.8 统计分析40-41
• 2 结果41-44
• 2.1 动物总体情况观察和足趾容积检测41
• 2.2 qPCR实验结果41-42
• 2.3 qPCR与芯片结果对比42-44
• 讨论44-53
• 1 基因芯片技术选择与运用44-45
• 2 选穴依据45-46
• 3 氧化磷酸化可能是艾灸作用的重要参与信号通路46-49
• 4. COX7A2、ATP6VOD2、ATP5J可能是艾灸后穴位局部氧化磷酸化通路的潜在分子靶点49-53
• 结论53-54
• 问题与展望54-55
• 致谢55-56
• 参考文献56-62
• 附件一62-69
• 附件二：综述69-76
• 参考文献73-76
• 附件三：在读期间公开发表的学术论文76-77

【参考文献】

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本文编号：337158