基于胆碱能抗炎通路的艾灸治疗实验性RA作用机制研究

发布时间：2017-09-30 03:08

  本文关键词：基于胆碱能抗炎通路的艾灸治疗实验性RA作用机制研究

  更多相关文章： 艾灸 类风湿性关节炎 胆碱能抗炎通路 信号转导通路

【摘要】：目的： 本研究依据“艾灸治疗RA抗炎效应明确,胆碱能抗炎通路对全身和局部炎症均具有明显的抑制作用”的基本事实,以针灸理论为指导,艾灸家兔“肾俞”、“足三里”治疗实验性RA,围绕滑膜炎症关键病理环节,选择胆碱能抗炎通路作为研究切入点,以“艾灸刺激一胆碱能抗炎通路一抗炎效应”为研究主线,运用神经阻断、免疫组化、实时荧光定量PCR等方法技术,探索胆碱能抗炎通路在艾灸治疗RA抗炎效应中的作用机制,对于深化艾灸治疗RA的原理研究、丰富灸法的科学内涵具有重要的价值和意义。 方法： 将日本大耳白兔随机分为正常对照组、RA模型组、艾灸治疗组、艾灸治疗迷走神经切断组、艾灸治疗假手术组,用福氏完全佐剂塑造RA疾病模型,运用颈部左侧迷走神经干切断术作为干预手段,艾灸“肾俞”、“足三里”治疗。1.观察RA家兔的整体状况、体重、膝关节周长、滑膜组织炎症病理形态；2.采用Elisa法检测滑膜液中TNF-α、IL-1、IL-6、HMGB1含量；3.采用Elisa法检测血清中a7nAChR和ChAT的含量；分别采用免疫组化法和实时荧光定量PCR法检测滑膜组织中a7nAChR、ChAT的蛋白表达和mRNA表达。4.采用免疫组化法检测滑膜组织中NF-κBp65、NF-κBp50、IκBα、IKKβ的表达。 结果： 1.艾灸家兔“肾俞”、“足三里”可以明显改善RA家兔全身状况、膝关节肿胀、关节滑膜炎症病理变化,而在切断迷走神经的情况下其作用显著降低。 2.滑膜液中细胞因子检测结果显示：模型组与正常对照组相比较,RA模型组关节滑膜液中TNFα、IL-1、IL-6、HMGB1含量显著增高(P0.01)；与RA模型组比较,艾灸治疗组、艾灸治疗假手术组关节滑膜液中TNFα、IL-1、IL-6、 HMGB1含量显著降低(P0.01),而艾灸治疗迷走神经切断组无明显降低((P0.05)；与艾灸治疗组比较,艾灸治疗迷走神经切断组滑膜液中TNFα、IL-1、 IL-6、HMGB1含量显著增高(P0.01),但艾灸治疗假手术组无明显增高(P0.05)。 3.α7nAChR、ChAT表达结果显示：模型组与正常对照组相比较,模型组血清中α7nAChR、ChAT含量、滑膜组织中α7nAChR、ChAT蛋白表达和mRNA表达均显著降低(P0.01)；与模型组比较,艾灸组和假手术组血清中α7nAChR、 ChAT含量、滑膜组织中α7nAChR、ChAT蛋白表达和mRNA表达均显著增高(P0.01),而艾灸治疗迷走神经切断组无明显增高(P0.05)；与艾灸组比较,艾灸治疗迷走神经切断组血清中α7nAChR、ChAT含量、滑膜组织中α7nAChR、ChAT蛋白表达和mRNA表达均显著降低(P0.01),但假手术组无明显降低(P0.05)。 4.①NF-κBp65、NF-κBp50、p-IκBα、IKKβ表达结果显示：模型组与正常对照组相比较,模型组滑膜组织中NF-κBp65、NF-κBp50、p-IκBα、IKKβ的表达显著增高(P0.01)；与模型组比较,艾灸组和假手术组滑膜组织中NF-κBp65、 NF-KBp50、p-IκBα、IKKβ的表达显著降低(P0.01),而艾灸治疗迷走神经切断组无明显降低(P0.05)；与艾灸组比较,艾灸治疗迷走神经切断组滑膜组织中NF-KBp65、NF-κBp50、p-IKBα、IKKβ的表达显著增高(P0.01),但假手术组无明显增高(P0.05)。 ②IκBα表达结果显示：模型组与正常对照组相比较,模型组滑膜组织中IκBα的表达显著降低(P0.01)；与模型组比较,艾灸组和假手术组滑膜组织中IκBα的表达显著增高(P0.01),而艾灸治疗迷走神经切断组无明显增高(P0.05)；与艾灸组比较,艾灸治疗迷走神经切断组滑膜组织中IκBα的表达显著降低(P0.01),但假手术组无明显降低(P0.05)。 结论： 1.艾灸家兔“肾俞”、“足三里”可以明显改善实验性RA家兔全身状况、膝关节肿胀、关节滑膜炎症病理变化,表明艾灸具有明确的抗炎消肿、抑制滑膜炎症作用,而在切断迷走神经的情况下其抗炎作用显著降低,提示艾灸治疗RA的抗炎效应可能与兴奋胆碱能抗炎通路密切相关。 2.艾灸家兔“肾俞”、“足三里”可以抑制实验性RA家兔滑膜液中细胞因子TNF-α、IL-1、IL-6和HMGB1水平,但在切断迷走神经的情况下其作用显著下降,提示兴奋胆碱能抗炎通路可能是艾灸抑制实验性RA家兔滑膜细胞分泌促炎细胞因子的重要机制之一。 3.艾灸家兔“肾俞”、“足三里”可以上调ChAT在RA家兔外周血和滑膜组织中的表达,激活免疫系统的固有胆碱能系统,但在切断迷走神经的情况下其作用显著降低,提示艾灸可能通过兴奋迷走神经释放ACh,并与免疫细胞表面的a7nAChR结合,从而激活免疫细胞的固有胆碱能系统,转化为免疫系统内弥散的、持续的免疫调节。 4.艾灸家兔“肾俞”、“足三里”可以抑制RA家兔滑膜组织中NF-κBp65、 NF-κBp50、p-IκBα、IKKβ的蛋白表达,上调IκBα的蛋白表达,但在切断迷走神经的情况下其作用显著降低,因此推测艾灸可能通过抑制IKK/IκB/NF-κB信号转导通路活化,改善RA家兔滑膜NF-κB的高调控状态,抑制滑膜细胞炎性细胞因子和炎性介质的合成和分泌,从而实现其抗炎效应,胆碱能抗炎通路在其中具有重要作用。
【关键词】：艾灸 类风湿性关节炎 胆碱能抗炎通路 信号转导通路
【学位授予单位】：成都中医药大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R245
【目录】：

• 中文摘要2-5
• Abstract5-9
• 目录9-13
• 中英文缩略词表13-15
• 引言15-18
• 第一部分 切断迷走神经对艾灸治疗实验性RA家兔抗炎效应的影响18-31
• 1 实验材料18-20
• 1.1 实验动物18
• 1.2 主要试剂18-19
• 1.3 实验药品19
• 1.4 主要仪器19
• 1.5 主要试剂的配置19-20
• 2 实验方法20-23
• 2.1 动物分组20
• 2.2 颈迷走神经干切断术20
• 2.3 RA模型塑造20-21
• 2.4 艾灸治疗方法21
• 2.5 滑膜组织取样21
• 2.6 检测指标方法21-23
• 2.6.1 一般情况观察21-22
• 2.6.2 膝关节周长测定22
• 2.6.3 滑膜组织形态学检测22-23
• 2.7 统计处理方法23
• 3 实验结果与分析23-31
• 3.1 动物一般情况比较23-24
• 3.2 各组家兔体重增长情况24-25
• 3.3 艾灸对实验性RA家兔膝关节周长的影响25-28
• 3.3.1 各组家兔右膝关节周长的比较25-26
• 3.3.2 各组家兔左膝关节周长的比较26-28
• 3.4 艾灸对实验性RA家兔关节滑膜病理形态的影响28-31
• 3.4.1 光镜下滑膜组织病理形态28-29
• 3.4.2 光镜下滑膜组织病变程度与积分29-31
• 第二部分 切断迷走神经对艾灸调控实验性RA家兔滑膜细胞分泌功能的影响31-38
• 1 实验材料31-32
• 1.1 实验动物31
• 1.2 主要试剂31
• 1.3 主要仪器31-32
• 2 实验方法32-33
• 2.1 动物分组及处理32
• 2.2 滑膜液的取样32
• 2.3 指标检测方法32-33
• 2.3.1 各组家兔滑膜液中TNF-α含量的检测32-33
• 2.3.2 各组家兔滑膜液中IL-1含量的检测33
• 2.3.3 各组家兔滑膜液中IL-6含量的检测33
• 2.3.4 各组家兔滑膜液中HMGB1含量的检测33
• 2.4 统计处理方法33
• 3 实验结果与分析33-38
• 3.1 艾灸对实验性RA家兔关节滑膜液TNF-α含量的影响33-34
• 3.2 艾灸对实验性RA家兔关节滑膜液IL-1含量的影响34-35
• 3.3 艾灸对实验性RA家兔关节滑膜液IL-6含量的影响35-36
• 3.4 艾灸对实验性RA家兔关节滑膜液HMGB1含量的影响36-38
• 第三部分 艾灸对实验性RA家兔胆碱能神经功能及相关受体的影响38-59
• 1 实验材料38-40
• 1.1 实验动物38
• 1.2 主要试剂38-39
• 1.3 主要仪器39-40
• 2 实验方法40-49
• 2.0 动物分组及处理40
• 2.1 血清的取样40
• 2.2 滑膜组织取样40
• 2.3 指标检测方法40-49
• 2.3.1 各组家兔血清中α7nAChR、ChAT含量的检测40-41
• 2.3.2 各组家兔滑膜组织中α7nAChR、ChAT蛋白表达的检测41-43
• 2.3.3 各组家兔滑膜组织中α7nAChRmRNA和ChATmRNA表达水平检测43-49
• 2.3.3.1 组织总RNA的抽提43-44
• 2.3.3.2 组织总RNA的鉴定与评估44-46
• 2.3.3.3 RNA逆转录合成cDNA46
• 2.3.3.4 引物设计46-47
• 2.3.3.5 实时荧光定量聚合酶链式反应47-48
• 2.3.3.6 实时荧光定量PCR反应结果分析48-49
• 2.4 统计处理方法49
• 3 实验结果与分析49-59
• 3.1 艾灸对实验性RA家兔血清中α7nAChR含量的影响49-50
• 3.2 艾灸对实验性RA家兔血清中ChAT含量的影响50-51
• 3.3 艾灸对实验性RA家兔滑膜组织α7nAChR蛋白表达的影响51-52
• 3.4 艾灸对实验性RA家兔滑膜组织中ChAT蛋白表达的影响52-53
• 3.5 艾灸对实验性RA家兔滑膜组织α7nAChRmRNA表达水平的影响53-56
• 3.5.1 滑膜组织α7nAChRmRNART-PCR扩增曲线及熔解曲线分析53-55
• 3.5.2 滑膜组织α7nAChRmRNA表达水平55-56
• 3.6 艾灸对实验性RA家兔滑膜组织ChATmRNA表达水平的影响56-59
• 3.6.1 滑膜组织ChATmRNA RT-PCR扩增曲线及熔解曲线分析56-57
• 3.6.2 滑膜组织ChATmRNA表达水平57-59
• 第四部分 切断迷走神经对艾灸调控实验性RA家兔滑膜细胞NF-κB信号通路的影响59-68
• 1 实验材料59-60
• 1.1 实验动物59
• 1.2 主要试剂59
• 1.3 主要仪器59-60
• 2 实验方法60-63
• 2.1 动物分组及处理60
• 2.2 滑膜组织的取样60
• 2.3 指标检测方法60-62
• 2.3.1 RA家兔滑膜组织中NF-κBp65蛋白表达的检测61
• 2.3.2 RA家兔滑膜组织中NF-κBp50蛋白表达的检测61-62
• 2.3.3 RA家兔滑膜组织中IκBα蛋白表达的检测62
• 2.3.4 RA家兔滑膜组织中ρ-IκBα蛋白表达的检测62
• 2.3.5 RA家兔滑膜组织中IKKβ蛋白表达的检测62
• 2.4 免疫组化结果的图象分析62
• 2.5 统计处理方法62-63
• 3 实验结果与分析63-68
• 3.1 艾灸对实验性RA家兔关节滑膜组织NF-κBp65表达的影响63-64
• 3.2 艾灸对实验性RA家兔关节滑膜组织NF-κBp50表达的影响64-65
• 3.3 艾灸对实验性RA家兔关节滑膜组织IκBα表达的影响65-66
• 3.4 艾灸对实验性RA家兔关节滑膜组织ρ-IκBα表达的影响66-67
• 3.5 艾灸对实验性RA家兔关节滑膜组织IKKβ表达的影响67-68
• 讨论68-104
• 1 中医对类风湿性关节炎的认识68-71
• 1.1 中医对类风湿性关节炎病名的认识68-69
• 1.2 中医对类风湿性关节炎病因病机的认识69-71
• 1.2.1 正气亏虚,腠理空虚是痹证发生的根本内在因素69-70
• 1.2.2 感受外邪是致痹的重要条件70-71
• 1.2.3 “痰瘀凝结,经脉不通”是痹症发病的病理关键71
• 2 现代医学对RA的认识71-75
• 2.1 滑膜炎症72
• 2.2 细胞因子72-74
• 2.3 信号转导通路74-75
• 3 胆碱能抗炎通路与炎症75-78
• 3.1 胆碱能抗炎通路的炎症调节机制75-77
• 3.2 胆碱能抗炎通路对炎症因子合成与释放的影响77
• 3.3 胆碱能抗炎通路的信号转导77-78
• 3.4 胆碱能抗炎通路调控炎症性疾病78
• 4 动物模型的选择78-80
• 5 灸法使用与穴位的选择80-83
• 6 胆碱能抗炎通路在艾灸治疗实验性RA家兔抗炎效应中的作用83-86
• 6.1 艾灸对实验性RA家兔整体状况及体重的影响83
• 6.2 艾灸对实验性RA家兔膝关节周长的影响83-84
• 6.3 艾灸对实验性RA家兔滑膜组织病理形态的影响84-86
• 7 胆碱能抗炎通路在艾灸调控实验性RA家兔滑膜细胞分泌功能中的作用86-92
• 7.1 艾灸对实验性RA家兔滑膜液TNF-α含量的影响及其意义86-88
• 7.2 艾灸对实验性RA家兔滑膜液IL-1含量的影响及其意义88-89
• 7.3 艾灸对实验性RA家兔滑膜液IL-6含量的影响及其意义89-90
• 7.4 艾灸对实验性RA家兔滑膜液HMGB1含量的影响及其意义90-92
• 8 艾灸对实验性RA家兔胆碱能神经功能及相关受体的影响92-95
• 8.1 艾灸对实验性RA家兔血清及滑膜组织中α7nAChR表达的影响及其意义93-94
• 8.2 艾灸对实验性RA家兔血清及滑膜组织中ChAT表达的影响及其意义94-95
• 9 艾灸对实验性RA家兔滑膜细胞NF-κB信号通路的影响及其胆碱能神经的调控95-104
• 9.1 艾灸对实验性RA家兔滑膜细胞NF-κBp65、NF-κBp50表达的影响及其胆碱能神经的调控99-100
• 9.2 艾灸对实验性RA家兔滑膜细胞ρ-IκBα、IκBα含量的影响及其胆碱能神经的调控100-102
• 9.3 艾灸对实验性RA家兔滑膜细胞IKKβ含量的影响及其胆碱能神经的调控102-104
• 结论104-105
• 本研究的创新点105-106
• 问题与展望106-107
• 致谢107-108
• 参考文献108-118
• 附件118-137
• 附件1：综述118-128
• 参考文献124-128
• 附件2：附图128-137
• 1. 颈左侧迷走神经干切断术128-129
• 2. 兔滑膜组织病理图谱129-130
• 3. 兔滑膜组织免疫组化图片130-137
• 在读期间公开发表的学术论文、专著及科研成果137-138

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前10条

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本文编号：945773